Файл: Обоснование выбора темы и ее актуальность 7.docx

1.2. Известные эксперименты по облучению биологических объектов

Экспериментальные исследования радиационного канцерогенеза у животных использовались для разработки биологических принципов, применимых к оценке риска для человека, а также для разработки и тестирования механистических моделей. Длительные исследования на животных, проводившиеся с 1950-х по 1980-е годы, предоставили значительный объем количественной информации о зависимости доза-реакция для ряда радиационно-индуцированных опухолей после гамма-облучения, а также о влиянии мощности дозы и фракционирования на эти зависимости. Исследования также были сосредоточены на канцерогенных эффектах нейтронов спектра деления. Эти исследования были в основном завершены до 1990 г.

Основные выводы, сделанные в результате исследований, заключались в следующем:

1 Зависимость доза-реакция для индукции рака после гамма-облучения обычно может быть описана линейно-квадратичной функцией.

2 Снижение мощности дозы привело к уменьшению канцерогенных эффектов при высоких суммарных дозах за счет уменьшения квадратичной составляющей; зависимость доза-реакция была линейной в широком диапазоне общих доз.

3 Линейный наклон отклика при низких дозах был подобен наклону линейной части линейно-квадратичной функции после воздействия высокой мощности дозы.

На основании исследований облучения животных нейтронами наблюдалась линейная доза-реакция для индукции большинства опухолей в дозах от 0,0 до 0,2 Гр; за ним следовало плато или изгиб кривой при более высоких дозах. Снижение мощности дозы либо не влияло на зависимость доза-реакция в диапазоне низких доз, либо, в некоторых случаях, увеличивало ответ на единицу дозы. Различия в форме кривой доза-реакция для индукции рака гамма-лучами и нейтронами привели к присвоению довольно высоких значений относительной биологической эффективности (ОБЭ) для индукции рака при низких дозах. Все приведенные выше данные согласуются с биофизическими моделями воздействия радиации, применимыми к целому ряду других конечных точек, включая радиационно-индуцированную гибель клеток, индукцию хромосомных аберраций, и радиационно-индуцированная мутация. Эти модели предсказывали линейно-квадратичную зависимость доза-реакция и снижение эффективности на единицу дозы радиации с низкой ЛПЭ при низких дозах и низких мощностях дозы.

---

¹⁷

Из-за их согласованности с проекциями биофизических моделей радиационных эффектов комбинация данных о доза-эффект и мощность дозы для индукции опухоли, полученных в исследованиях на животных, и данных о различных конечных точках в клетках животных и человека обеспечивают существенную поддержку для применения дозы.

Высокие ОБЭ для нейтронов при низких дозах (также предсказанные на основе биофизических моделей), наблюдаемые в исследованиях на животных, сыграли важную роль в модификации факторов качества, используемых при оценке риска для нейтронов.

После анализа результатов долгосрочных исследований было признано, что понимание радиационных рисков при низких дозах не улучшится, если попытаться измерить воздействие низких доз на животных, а скорее потребует лучшего понимания лежащих в их основе механизмов. В результате экспериментальные исследования канцерогенеза со времени последнего отчета были сосредоточены на механизмах, а также на клеточных и молекулярных событиях, связанных с неоплазией. За это время понимание молекулярных событий, участвующих в процессе канцерогенеза, в целом резко возросло. В настоящее время ясно, что развитие рака влечет за собой изменения во многих генах, которые участвуют в регуляции прохождения клеточного цикла, роста и дифференцировки клеток и гибели клеток, а также в генах, которые участвуют в поддержании геномной точности. Ряд исследователей в настоящее время продемонстрировали, что изменения в генах, которые контролируют геномную точность, могут играть главную роль в ранних событиях, ведущих к раку, придавая пораженным клеткам мутаторный фенотип. Клетки с изменениями в других критических генах позже возникают в результате клональной селекции.

Длительные латентные периоды и сложность опухолевого процесса были препятствиями в выявлении специфических радиационных эффектов, которые инициируют последовательность событий в развитии рака на клеточном и молекулярном уровне. Однако можно сделать некоторые обобщения. Исследования как in vitro, так и in vivo убедительно продемонстрировали, что радиация действует главным образом на уровне инициации канцерогенного процесса и значительно менее эффективна в продвижении уже инициированных клеток или влиянии на прогрессирование неоплазии.

Механизмы, посредством которых радиация инициирует канцерогенез, до сих пор плохо изучены. Общепризнано, что канцерогенное действие радиации связано с ее кластогенным и мутагенным действием, но причинно-следственной связи между изменениями в конкретных генах и развитием радиационно-индуцированного рака не установлено. Фактически, частоты инициации, полученные в недавних исследованиях, в которых использовались модели радиационно-индуцированного рака in vivo/in vitro (с частотами инициации около 10

---

^-2 инициированных клеток на Гр) несовместимы с мишенью, размер которой ограничен конкретным геном или даже семейством из нескольких генов/

Скорее, эти частоты указывают на то, что клеточная мишень для инициации канцерогенеза после облучения составляет значительную часть всего генома. Такие результаты привели к новым подходам в изучении возможных механизмов радиационного канцерогенеза. Основное внимание в текущих исследованиях уделяется роли радиационно-индуцированной генетической нестабильности в канцерогенезе.

Примерно в 2008 году MELODI предприняла большую работу по сбору всех архивов и тканей из исследований облучения животных, проведенных в Европе. Результатом этого стал Европейский радиобиологический архив (ERA), который доступен всем исследователям во всем мире, а некоторые исследования на животных, включенные в эту коллекцию и базу данных, включают исследования с низкой мощностью дозы (Birschwilks et al. 2012 ) ; www.bfs.de/EN/bfs/science-research/projects/era/era_node.html.

В США Министерство энергетики (DOE) собрало архивные образцы тканей и базы данных из долгосрочных исследований с участием примерно 49 000 мышей, 28 000 собак и 30 000 крыс. Данные многих из этих исследований доступны на веб-сайте janus.northwestern.edu/wololab. Хотя многие из этих экспериментальных исследований на животных были проведены с низкими дозами и исследования были опубликованы, возможность их повторного анализа с использованием новых статистических и вычислительных подходов позволила оценить данные с новой точки зрения.¹⁸

Развитие трансгенных и генетически ориентированных технологий получения эмбриональных стволовых клеток мыши в 1980-х годах способствовало созданию генно-инженерных моделей мышей (GEM) для изучения биологии опухолей посредством манипуляций с зародышевой линией мыши. Наиболее распространенными способами создания мышиных моделей рака являются активация онкогенов или инактивация генов-супрессоров опухолей in vivo с использованием трансгенных подходов. В исследованиях потери функции обычно используются нокаутирующие или условно-нокаутирующие аллели, в то время как в исследованиях усиления функции используются трансгенные, условно-трансгенные и нокаутирующие подходы.

Трансгенных мышей создают путем микроинъекции чужеродной ДНК в пронуклеусы оплодотворенных зигот. После введения трансгенные последовательности интегрируются в случайные участки генома мыши с переменной частотой.

---

Первые эксперименты по изучению влияния предварительных облучений на выживаемость животных при повторном облучении их в смертельных дозах проведены Кронкайтом и др., а также Бетцем. По данным первых, предварительное трехкратное облучение мышей в сублетальной дозе 144 р с недельными интервалами между облучениями (144X3) приводит к снижению смертности мышей после повторного облучения в дозе 703 р. Смертность мышей после однократного облучения в дозе 703 р составляет 41 %ь предварительное облучение 3 раза по 144 р снижает смертность при повторном облучении в дозе 703 р до 26%.

Такое же снижение смертности наблюдал Бетц. После предварительного облучения мышей в дозе 500 р их повторно через 7, 10 и 15 суток облучали в дозе 700 р. Все контрольные животные, облученные однократно в дозе 700 р, погибли в течение 10 суток, тогда как в группах с предварительным облучением к концу месяца погибло 80, 75 и 64% мышей соответственно.¹⁹

Однако имеются данные, свидетельствующие о том, что предварительное облучение не обусловливает «защитного» эффекта, т. е. не приводит к повышению резистентности. Однократное предварительное облучение в дозах 100-400 р отчетливо снижало радиорезистентность кроликов самцов к повторному облучению в дозе 400 р. По данным Мезена и др., предварительно облученные крысы после повторного облучения в дозе 500 р погибали раньше контрольных крыс. Это происходило при условии, что предварительное облучение достигало 200 р, а повторное облучение проводили в промежутки, равные трем неделям или меньше. Пигури и др. повторили эксперименты на крысах.

С. Н. Александров и К. Ф. Галковская подтвердили это в опытах на мышах, предварительно облучая их в дозах 120 и 240 р, а затем повторно через различные интервалы времени (от 7 до 90 суток) в дозе 400 р. Видны колебания радиорезистентности облученных мышей, а также зависимость ее от дозы первого облучения. При дозе 120 р отмечено два периода повышения радиорезистентности, а после дозы 240 р один. Причем эти периоды не совпадают по срокам.

Интересные данные получены после предварительного облучения мышей в дозе 240 р. Повторное облучение их через 2 недели в дозе 800 р снижало смертность мышей на 50% по сравнению с однократным облучением в дозе 800 р. Авторы установили прямую связь между количеством антител против собственных денатурированных белков тканей животных и смертностью их от лучевого воздействия.

Этими же исследователями проведена большая работа по выяснению условий, способствующих возникновению повышенной резистентности к излучению после предварительного облучения. Мышей облучали 1-3 раза в разовых дозах 119 р с интервалами между облучениями 7 суток. Через 14 суток животных повторно облучали в дозе ЛД90 (700 р). Видно, что предварительное облучение значительно снижает смертность животных. Повышение резистентности организма находится в прямой зависимости от кратности предварительного облучения. Наименьшая смертность наблюдалась после однократного предварительного облучения (119 р), после трехкратного облучения отмечено значительное увеличение смертности (до 82,5%).

---

²⁰

Для выяснения, что является наиболее важным в развитии наблюдаемой резистентности - величина дозы или кратность предварительного облучения, поставлены опыты по облучению мышей в большей дозе (240 р), но с сохранением той же кратности. Результаты этих опытов показали, что, несмотря на увеличение в 2 раза дозы предварительного облучения, также наблюдали повышение резистентности. Так, если трехкратное облучение мышей (119 р ХЗ) в суммарной дозе 357 р почти не приводило к увеличению резистентности, двукратное облучение в дозе 246 р (суммарная доза 492 р) значительно увеличивало выживаемость (61% по сравнению с 5% в контроле).

Действие высоких дох радиации вызывает повреждение кишечника и печени в первые недели после облучения, что влияет на усвоение пищи и приводит к изменению массы животных. Из литературы известно, что острое облучение в высоких дозах приводит к стойкому снижению массы тела. Изменения в картине крови являются основными признаками при воздействии гамма-излучения в значительных дозах. Когда кроветворная система подвергается действию ионизирующего излучения, в первую очередь нарушается ее гомеостаз. Лимфоидная ткань обедняется клеточными элементами раньше, чем ткань костного мозга. Причем, лимфопения - снижение общего числа лимфоцитов - развивается сразу после острого воздействия даже низких доз излучения, в то время как зрелые гранулоциты, эритроциты и тромбоциты могут переносить более высокие дозы.²¹

Истощение пула гемопоэтических стволовых клеток, вызванное действием облучения, увеличивает нагрузку на дифференцированные клетки, усиливаются процессы репарации и апоптоза. Изменения в обменных процессах клеток и тканей вносят изменения в сывороточный гомеостаз. Биохимические сдвиги в крови облученных животных отчетливо выражены лишь в разгар лучевого поражения, оставаясь на начальных этапах поражения малозаметными. Однако метод ЛКС позволяет увидеть изменения даже на ранних стадиях повреждающего процесса.

Целью работы²² является отработка способов позиционирования животных в зоне облучения, получение дозовых зависимостей количества цитогенетических повреждений в костном мозге, клеточности тимуса и селезенки, продукции АФК и повреждений ДНК в цельной крови при облучении мышей in vivo ускоренными ионами углерода с энергией 450 МэВ/н в пике Брэгга и рентгеновским излучением в диапазоне доз от 0,1 до 1,5 Гр.

---