Файл: Обоснование выбора темы и ее актуальность 7.docx

Исследования проводили на мышах in vivo в помещении временного радиобиологического стенда ускорительного комплекса У-70 (г. Протвино). Облучение двухмесячных самцов линии SHK пучком ионов углерода с энергией 450 МэВ/нуклон проходило в режиме медленного вывода 1 раз в 8 сек, длительность выпуска – 0,6 сек.

Облучение рентгеновскими лучами осуществлялось на установке РУТ при напряжении 200 кВ и средней мощности дозы 1 Гр/мин (г. Пущино). Облучение вели с сопровождением каждой экспозиции дозиметрической пленкой «EBT 3» (Gafchromic® film). На каждую экспериментальную точку использовали не менее 6 мышей. ²³

Животных выводили из эксперимента методом декапитации через 28 ч после воздействия. Критерием цитогенетических повреждений служил процент полихроматофильных эритроцитов с микроядерами в костном мозге. Относительные массы тимуса и селезенки были рассчитаны по отношению среднего абсолютного веса органа к среднему весу животного в группе. Уровень повреждений ДНК в лейкоцитах периферической крови оценивали с помощью «комета»-теста по количеству ДНК в хвосте кометы (%TDNA) и доли клеток с неповрежденной ДНК (% клеток, не имеющих хвоста «комет»). Уровень продукции АФК измеряли в цельной крови методом люминол-зависимой зимозаниндуцированной хемилюминесценции с помощью 12-канального прибора CHEMILUM-12 (Россия). Ответ хемилюминесценции в крови определяется, в основном, реакцией фагоцитирующих клеток, продуцирующих АФК.

Индекс активации рассчитывается как отношение индуцированной светоплощади к спонтанной и отражает резерв иммунной системы организма. Для оценки статистической достоверности различий между группами использовали t-критерий Стьюдента.

Таким образом, при облучении мышей ускоренными ионами углерода с энергией 450 МэВ/н в пике Брэгга и рентгеновским излучением в диапазоне доз от 0,1 до 1,5 Гр с помощью микроядерного теста была получена нелинейная дозовая зависимость выхода полихроматофильных эритроцитов с микроядрами и определено значение ОБЭ от 1,3 до 2,4, которое зависело от дозы; относительная масса тимуса и селезенки была значительно снижена при более низких дозах по сравнению с мышами, облученными рентгеновским излучением; присутствие повреждений в ДНК лейкоцитов наблюдалось через 24 ч после облучения при дозах от 0,3 Гр до 1,5 Гр в отличие от рентгеновского излучения; индекс активации хемилюминесценции снижался с увеличением дозы облучения ионами углерода, что свидетельствует об истощении резерва защитных систем организма.

---

²⁴

Большинство исследований трансгенных мышей ограничены тем фактом, что они являются несовершенными моделями человеческой ситуации. Например, у животных с онкогенными мутациями развивается рак, но они часто похожи, но не идентичны человеческим заболеваниям. Другое ограничение заключается в том, что большинство заболеваний человека, которые моделируются в трансгенных ситуациях, имеют мультигенные причины, но создание трансгенной мыши часто предполагает, что за заболевание отвечает один ген. На самом деле трансгенная модель является средством проверки молекулярных последствий определенного генетического изменения, но имитация болезни может быть ограничена. Ограничения моделей были отмечены практически для всех изученных моделей животны.

Аналогичные ограничения присутствуют и в сотовых моделях. Любой эксперимент in vitro ограничен наблюдаемыми конечными точками и чувствительностью анализов. Несмотря на эти ограничения, из таких экспериментов можно извлечь ценную информацию, если эти результаты не будут экстраполированы за пределы контекста модели и экспериментальной установки.

Было проведено несколько исследований, в которых изучалась экспрессия генов и белков у животных, предрасположенных к определенным состояниям (либо генетически модифицированным, либо имеющим фоновые генетические мутации), с использованием воздействия LDR. Все они показали различия в паттернах экспрессии генов между мышами, подвергшимися воздействию LDR и HDR, а также различия в активации лимфоцитов и экспрессии цитокинов. Среди тканей был выявлен тканеспецифический ответ, связанный с различиями в процессах репарации повреждений ДНК. Сообщалось также, что изменения в ходе клеточного цикла демонстрируют влияние мощности дозы с увеличением выживаемости, накоплением клеток в фазе G2 после LDR и задержкой синтеза ДНК.²⁵

Базой для совершенствования радиобиологических моделей являются данные экспериментальных исследований, проведенных в МРНЦ им. А.Ф. Цыба с использованием пучка ускоренных ионов углерода (435 МэВ/нуклон), нейтронного импульсного излучения генератора ИНГ-103 и смешанного нейтронного излучения импульсного ядерного реактора БАРС-6 («ГНЦ РФ – ФЭИ», г. Обнинск).

Характеристики излучения ядерного реактора БАРС-6 позволяют оценивать эффективность совместного действия гамма-излучения (с вкладом гамма 20-40 % в суммарную дозу) и нейтронов при мощностях доз, различающихся более чем в 10

---

⁷ раз. Показано, что в зависимости от вида, величины энергии, мощности дозы, дозового состава излучения наблюдаются разные цитогенетические эффекты. Так, при облучении лимфоцитов человека смешанное гамма-нейтронное излучение реактора с мощностью дозы 10⁶ Гр/мин было менее (на 60-80 %) эффективно по сравнению с пролонгированным (10-2 Гр/мин) по суммарной частоте АХ с максимумом повышения по отдельным видам аберраций, т. е наблюдался обратный эффект сверхвысокой мощности дозы.

Величина ОБЭ, рассчитанная из начальных наклонов дозовых кривых суммарной частоты АХ, составляла 15-20. Феномен гиперчувствительности/индуцированной радиорезистентности (ГЧ/ИР) по тесту образования АХ наблюдали как на лимфоцитах человека, так и клетках китайского хомячка СНО-К1 при облучении нейтронами с энергией 14,5 МэВ в диапазоне доз до 0,5 Гр на импульсном генераторе. При этом в лимфоцитах человека наблюдался обратный эффект мощности дозы нейтронов в диапазоне малых мощностей доз (0,3-60 мГр/мин).²⁶

Помимо мышей, другие животные и культивируемые клетки были проанализированы на предмет экспрессии генов и модификаций белков после воздействия LDR.

Изменения в нескольких генах, связанных с рибосомными белками, мембранным транспортом, дыханием и антиоксидантной регуляцией для повышенного удаления активных форм кислорода (АФК), также наблюдались в экспериментах, проведенных на культурах клеток и организмах млекопитающих. В недавней статье Fischietti et al. сообщили, что мышиная гибридома pKZ1, растущие под землей на ЛГС, демонстрируют качественно иную реакцию на стресс; индуцированный чрезмерным ростом по отношению к внешней референс-лаборатории. Анализ белков, которые, как известно, участвуют в реакции клеток на стресс, показал, что после 96 часов роста культура клеток, хранящаяся во внешней лаборатории, показывает увеличение расщепления PARP1, раннего маркера апоптоза, в то время как клетки, выращенные под землей, демонстрируют переключение от апоптоза к аутофагии, которая, по-видимому, опосредована p53. На это поведение не влияет дальнейшее снижение дозы гамма-излучения за счет экранирования. Интересно, что этот эффект вернулся, когда после 4 недель подземного культивирования клетки были перемещены в референтную радиационную среду еще на 2 недели, что указывает на пластичность клеток в их реакции на среду с низким уровнем радиации. В настоящее время проводится транскриптомный анализ и анализ метилирования, чтобы понять генетические и эпигенетические основы наблюдаемых эффектов. Крайне важно также попытаться идентифицировать компонент(ы) спектра излучения, вызывающий биологическую реакцию.

---

В целом данные свидетельствуют о том, что биологические системы являются очень хорошими датчиками изменений в радиационном воздействии окружающей среды, в частности в отношении эффектов мощности дозы, а также подтверждают гипотезу о том, что радиация окружающей среды способствует развитию и поддержанию защитной реакции в клетках и культивируемых организмах. Тем не менее, следует отметить, что экстраполяция экспериментальных клеточных или животных моделей на человека очень сложна, поскольку зависит от многих параметров, включая модель, конечные точки и тип радиационного облучения. Необходима дополнительная работа, чтобы определить, какие модели лучше всего подходят для определенных конечных точек человека.

Ранние исследования были проведены Уильямом и Линн Рассел в Национальной лаборатории Ок-Риджа в 1960-х годах по изучению развития мутаций окраски шерсти у мышей после воздействия гамма-лучей. Эта работа в настоящее время считается классической и помогла установить, что воздействие HDR 8 мГр/мин или менее вызывало меньшее количество наследственных мутаций у мышей по сравнению с той же дозой, введенной при LDR.²⁷

Исследование радиобиологических реакций растений началось практически сразу после открытия рентгеновского излучения в 1895 г. Уже на этом этапе были обнаружены разнообразные по своей природе реакции клеток, растений и их популяций на облучение. Резкое увеличение числа исследований в этой области в 60–70 гг. прошлого века было обусловлено работами по мутационной селекции и стимуляции развития растений облучением, а также необходимостью оценить возможные последствия глобальной ядерной войны. Дальнейший рост публикаций по радиобиологии растений был связан с необходимостью оценки экологических последствий радиационных катастроф в Чернобыле и на Фукусиме.

Классической радиобиологией детально исследованы закономерности формирования разных радиационных эффектов (индукция мутаций, гибель клеток, поражение отдельных структур и функций, формирование уродств и аномалий развития, угнетение роста и размножения, гибель организма) в зависимости от дозы и мощности облучения. При этом установлена общая закономерность: по мере снижения дозы уменьшается и степень проявления наблюдаемого эффекта. Однако в области малых доз монотонный характер зависимости доза-эффект существенно меняется, что связано с качественным различием в биологическом действии больших и малых доз ионизирующего излучения. Более того, в области малых доз возникают явления, не наблюдающиеся при больших дозах облучения, вплоть до диаметрально противоположных эффектов, при которых ингибирование физиологических процессов сменяется их стимуляцией. В основе такой реакции организма на облучение в малых дозах и слабые внешние воздействия некоторых других факторов лежат фундаментальные эволюционно выработанные механизмы обеспечения устойчивости живых систем и возможности их адаптации к изменяющимся условиям внешней среды.

---

²⁸

Наблюдаемые в этой области эффекты обусловлены не столько повреждающим действием ионизирующего излучения либо иных факторов физической или химической природы, сколько особенностями реализации ответной реакции клетки и организма на слабое внешнее воздействие и являются результатом развертывания во времени генетической программы, выбор конкретного варианта которой определяется интенсивностью и характером внешнего воздействия.

Проведенные в США, Канаде, Франции и СССР в 60−70 гг. прошлого века эксперименты по облучению природных и искусственных биоценозов позволили описать динамику процессов лучевого поражения и пострадиационного восстановления в ценозах разных типов и установить величину дозовых нагрузок, приводящих к радиационноиндуцированным сдвигам в экосистемах. Типичными реакциями растительного ценоза на облучение в высокой дозе являются снижение видового разнообразия, изменение доминантности видов, уменьшение продуктивности растений и изменение структуры сообщества. Если радиочувствительный вид является к тому же эдификаторным, то изменение его роли в сообществе неизбежно ведет к изменению облика всего фитоценоза.²⁹

Семена салата Lactuca sativa L. сорта Московский парниковый облучали протонами с энергией 30 и 235 МэВ на ускорителе Национального Института Радиологических Наук (NIRS, QST, г. Чиба, Япония) в дозах 1, 50 и 100 мГр. Семена проращивали, оценивали первичные ростовые процессы, а также цитогенетические нарушения в ана-телофазах первого митоза меристемы корня.

Отмечено некоторое увеличение энергии прорастания и всхожести облучённых семян по сравнению с контрольными семенами. Тогда как на цитогенетическом уровне наблюдается достоверное увеличение процента аберрантных клеток и клеток с множественными хромосомными повреждениями. Частота хромосомных аберраций при облучении семян протонами с энергией 30 МэВ увеличена при дозе 50 мГр по сравнению с дозами 1 и 100 мГр. Тогда как после облучения протонами с энергией 235 МэВ процент клеток с хромосомными аберрациями и клеток с множественными аберрациями остаётся на одном уровне при всех рассмотренных дозах.³⁰

---