Файл: Практическая работа 10. Изучение состава нуклеиновых кислот.docx
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 25.10.2023
Просмотров: 238
Скачиваний: 4
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Практическая работа 10.Изучение состава нуклеиновых кислотЦель работы: изучить особенности методов выделения, фракционирования, идентификации и состава нуклеиновых кислот.
Рассмотрим наиболее часто используемые методики выделения нуклеиновых кислот.ВЫДЕЛЕНИЕ ФЕНОЛ-ХЛОРОФОРМОМРис. 1. Протокол выделения фенол-хлороформным методом.Впервые данный метод был применен в 1967 года, и является одним из самых распространённых способов выделения нуклеиновых кислот.Суть методики: получаемый клеточный лизат после разрушения тканей протеиназой К и SDS буфером, смешивая с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в пропорции 25:24:1 с последующим центрифугированием смеси, дает разделение раствора на две фазы: водную и органическую, причем все липиды и жиры находятся в органической (нижней) фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной (верхней) фазе. Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Если раствор будет иметь низкий pH, то ДНК перейдёт в органическую фазу, а РНК останется в водной фазе, что позволяет выделять РНК отдельно от ДНК.ВЫДЕЛЕНИЕ НА СПИН-КОЛОНКАХРис. 2. Протокола выделения на спин-колонках.Выделения на спин-колонках (спин-basket) - усовершенствованный метод экстракции на частичках силики, предложенный американскими учёными в 1979 году. Принцип метода: в щелочных условиях и при повышенных концентрациях соли ДНК связывается с силикатами, что позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики со связанной ДНК. пин-basket сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на него и последующем центрифугировании на малых оборотах центрифуги ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё. Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца, путем переворачивания спин-basketвверх дном и центрифугирования.ВЫДЕЛЕНИЕ НА МАГНИТНЫХ ЧАСТИЦАХ
Рис. 3.Протокола выделения на магнитных частицах.В основе данного метода лежит получение лизата классическим способом, но с добавлением магнитных частиц. Принцип метода: выделенная нуклеиновая кислота связывается с веществом, покрывающим магнитные частицы (целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др.). После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют (Рис.3).ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ТЕМПЕРАТУРНО-ЗАВИСИМОЕ ВЫДЕЛЕНИЕРис. 4. Протокол ферментативного температурно-зависимого выделения. Практически все способы выделения основаны на первом этапе – получение лизата, используя протеиназу К и SDS, которые разрушают клеточные стенки и высвобождают нуклеиновые кислоты. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Однако не все образцы поддаются простому лизису, и в таком случае используют более сложные лизирующие составы.Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку.MicroGEM предложил новую методику, которая позволяет сократить время выделения нуклеиновых кислот, благодаря применению термофильной протеиназы EA1 вместе с мезофильными гидролазами.Процесс ферментативного температурно-зависимого выделения начинается со смешивания буфера и ферментов с образцом. При последующей инкубации при комнатной температуре гидролазы деградируют клеточные стенки. После этого пробирку нагревают до 75°C, что активирует работу протеиназы EA1, которая разрушает белки и высвобождает нуклеиновые кислоты. Последующее нагревание до 95°C инактивирует EA1 (Рис.4). ВЫДЕЛЕНИЕ с помощью ионообменных смолЭкстракция ДНК с помощью ионообменной смолы. Метод основан на применении ионообменников типа Chelex.
Секвенирование ДНК — экспериментальный метод определения последовательного расположения оснований нуклеиновых кислот (A, T, G и C) в полинуклеотиде, кодирующем различные белки, которые функционируют в живой клеткеИонообменные смолы собирают примеси затрудняющие реакции, а не ДНК. Смола Chelex является сополимером стирола с дивинилбензолом, содержащим иминодиацетатные группы, связывающие поливалентные ионы металлов и относится к одному из старейших методов очистки ДНК. Данная методика включает две стадии: первая стадия - кипячение образца, вследствие этого происходит распад клеточной стенки, нуклеиновые кислоты попадают в раствор; вторая - на ионообменнике происходит сорбция примесей. Конечной целью выделения нуклеиновых кислот является их секвенирование - определение их аминокислотной или нуклеотидной последовательности. Секвенирование ДНК — метод определения последовательного расположения оснований нуклеиновых кислот (A, T, G и C) в полинуклеотиде, кодирующем различные белки, которые функционируют в живой клетке.В результате секвенирования получают описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. В результате секвенирования перекрывающихся участков ДНК получают последовательности участков генов, целых генов, тотальной мРНК и полных геномов организмов.Выделяют три поколения секвенирования:
-
Изучите теоретический материал к практической работе: выполните конспект, зарисуйте схемы – дайте письменное пояснение к ним.
-
Кровь -
Слюна -
Пото-жировые следы -
Сперма -
Влагалищный эпителий -
Волосы -
Ногтевые пластины -
Костная ткань и зубы -
Фрагменты тканей органов -
Трупный материал
-
при помощи силики (диоксид кремния): к образцу добавляют гуанидинтиоцианат, в результате чего все соединения денатурируют кроме ДНК, которая в дальнейшем связывается с силикой, что позволяет получить доастаточно читую молекулу из малоко количества исследуемого образца -
ионообменной смолы: метод предполагает применение лизирующего буфера с длительной инкубацией при температуре 70˚С, с последующим добавлением ионообменной смолы (Cheleх 100) и денатурацией при температуре 99˚С; -
магнитных частиц: метод заключается в том, что в исследуемый образец добавляются лизирующий буфер и магнитные шарики, которые в процессе работы фиксируют специальным магнитным штативом. Шарики связывают выделившуюся ДНК, а в процессе очищения происходит вымывание оставшихся клеточных элементов. Завершающим шагом становится элюирование молекулы низко солевым буфером. -
бумажных фильтров для исследования применяется специальная бумага (целлюлозный фильтр), которая пропитана сильными буферами, связывающими нуклеиновые кислоты, денатурируя при этом белки. Кислоты защищены фильтром от ультрафиолета и нуклеаз; -
гель-фильтрации: метод позволяет быстро разделить молекулы в соответствии с их размерами. Сам гель сформирован в виде гранул, расположенных поперечно, напоминая собою трёхмерную, молекулярную сетку или сито. В момент пропускания материала через колонку, наполненную этим гелием, происходит разделение веществ. После чего проводится очистка этилом или фенолом; -
органических растворителей: один из самых первых методов, который основан на применении смеси фенол-хлороформа. Достаточно токсичен. В настоящее время применяется для получения ДНК из трудно-выделяемых объектов – костная ткань, зубы; -
микроцентрифужных колонок.
Рассмотрим наиболее часто используемые методики выделения нуклеиновых кислот.ВЫДЕЛЕНИЕ ФЕНОЛ-ХЛОРОФОРМОМРис. 1. Протокол выделения фенол-хлороформным методом.Впервые данный метод был применен в 1967 года, и является одним из самых распространённых способов выделения нуклеиновых кислот.Суть методики: получаемый клеточный лизат после разрушения тканей протеиназой К и SDS буфером, смешивая с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в пропорции 25:24:1 с последующим центрифугированием смеси, дает разделение раствора на две фазы: водную и органическую, причем все липиды и жиры находятся в органической (нижней) фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной (верхней) фазе. Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Если раствор будет иметь низкий pH, то ДНК перейдёт в органическую фазу, а РНК останется в водной фазе, что позволяет выделять РНК отдельно от ДНК.ВЫДЕЛЕНИЕ НА СПИН-КОЛОНКАХРис. 2. Протокола выделения на спин-колонках.Выделения на спин-колонках (спин-basket) - усовершенствованный метод экстракции на частичках силики, предложенный американскими учёными в 1979 году. Принцип метода: в щелочных условиях и при повышенных концентрациях соли ДНК связывается с силикатами, что позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики со связанной ДНК. пин-basket сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на него и последующем центрифугировании на малых оборотах центрифуги ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё. Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца, путем переворачивания спин-basketвверх дном и центрифугирования.ВЫДЕЛЕНИЕ НА МАГНИТНЫХ ЧАСТИЦАХ
Рис. 3.Протокола выделения на магнитных частицах.В основе данного метода лежит получение лизата классическим способом, но с добавлением магнитных частиц. Принцип метода: выделенная нуклеиновая кислота связывается с веществом, покрывающим магнитные частицы (целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др.). После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют (Рис.3).ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ТЕМПЕРАТУРНО-ЗАВИСИМОЕ ВЫДЕЛЕНИЕРис. 4. Протокол ферментативного температурно-зависимого выделения. Практически все способы выделения основаны на первом этапе – получение лизата, используя протеиназу К и SDS, которые разрушают клеточные стенки и высвобождают нуклеиновые кислоты. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Однако не все образцы поддаются простому лизису, и в таком случае используют более сложные лизирующие составы.Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку.MicroGEM предложил новую методику, которая позволяет сократить время выделения нуклеиновых кислот, благодаря применению термофильной протеиназы EA1 вместе с мезофильными гидролазами.Процесс ферментативного температурно-зависимого выделения начинается со смешивания буфера и ферментов с образцом. При последующей инкубации при комнатной температуре гидролазы деградируют клеточные стенки. После этого пробирку нагревают до 75°C, что активирует работу протеиназы EA1, которая разрушает белки и высвобождает нуклеиновые кислоты. Последующее нагревание до 95°C инактивирует EA1 (Рис.4). ВЫДЕЛЕНИЕ с помощью ионообменных смолЭкстракция ДНК с помощью ионообменной смолы. Метод основан на применении ионообменников типа Chelex.
Секвенирование ДНК — экспериментальный метод определения последовательного расположения оснований нуклеиновых кислот (A, T, G и C) в полинуклеотиде, кодирующем различные белки, которые функционируют в живой клеткеИонообменные смолы собирают примеси затрудняющие реакции, а не ДНК. Смола Chelex является сополимером стирола с дивинилбензолом, содержащим иминодиацетатные группы, связывающие поливалентные ионы металлов и относится к одному из старейших методов очистки ДНК. Данная методика включает две стадии: первая стадия - кипячение образца, вследствие этого происходит распад клеточной стенки, нуклеиновые кислоты попадают в раствор; вторая - на ионообменнике происходит сорбция примесей. Конечной целью выделения нуклеиновых кислот является их секвенирование - определение их аминокислотной или нуклеотидной последовательности. Секвенирование ДНК — метод определения последовательного расположения оснований нуклеиновых кислот (A, T, G и C) в полинуклеотиде, кодирующем различные белки, которые функционируют в живой клетке.В результате секвенирования получают описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. В результате секвенирования перекрывающихся участков ДНК получают последовательности участков генов, целых генов, тотальной мРНК и полных геномов организмов.Выделяют три поколения секвенирования:
-
Технологии метода химической деградации, предложенные Максамом и Гилбертом, метод дидезокси-терминации цепи, разработанный командой Sanger в 1977 г., и автоматическое секвенирование с помеченной флуоресценцией в 1990-х гг. вместе сформировали первое поколение секвенирования (FGS). -
Секвенирование второго поколения (SGS) или секвенирование следующего поколения (NGS) относится к высокопроизводительным технологиям секвенирования ДНК, которые могут секвенировать миллионы или миллиарды нитей ДНК. При этом процесс определения последовательности происходит с использованием ферментативной репликации или амплификации, обеспечивающей значительную пропускную способность и многократное секвенирование целевых областей. -
Секвенирование третьего поколения (TGS) характеризуется путем добавления нуклеотидов по одному для получения длинных и точных результатов секвенирования, в то время как технология амплификации не используется. Одноклеточное секвенирование также характерно для технологии TGS.
-
Выполните практическую часть работы. Записать в тетрадь ход работы. После описания каждого опыта объяснить полученные результаты.