Практическая работа 10.
Изучение состава нуклеиновых кислот
Цель работы: изучить особенности методов выделения, фракционирования, идентификации и состава нуклеиновых кислот.

1. 
   Изучите теоретический материал к практической работе: выполните конспект, зарисуйте схемы – дайте письменное пояснение к ним.
   

Нуклеиновые кислоты – высокомолекулярные соединения, построенные из большого количества мононуклеотидов, соединенных друг с другом фосфодиэфирной связью. Мононуклеотиды состоят из пуринового или пиримидинового основания, углеводного компонента (рибозы или дезоксирибозы) и фосфорной кислоты. Нуклеиновые кислоты обладают кислотными свойствами вследствие диссоциации имеющихся у них остатков фосфорной кислоты. Различные нуклеиновые кислоты характеризуются входящими в их состав пуриновыми и пиримидиновыми основаниями и пентозами.

Дезоксирибонуклеиновая (ДНК) кислота представляет собой полимер, состоящий из мономеров – дезоксирибонуклеозидмонофосфатов.

Рибонуклеиновая (РНК) кислота является полимером, состоящим из рибонуклеозидмонофосфатов.
Источники выделения ДНК:

1. 
   Кровь
   
2. 
   Слюна
   
3. 
   Пото-жировые следы
   
4. 
   Сперма
   
5. 
   Влагалищный эпителий
   
6. 
   Волосы
   
7. 
   Ногтевые пластины
   
8. 
   Костная ткань и зубы
   
9. 
   Фрагменты тканей органов
   
10. 
    Трупный материал
    

Существует 7 способов экстракции ДНК:

1. 
   при помощи силики (диоксид кремния): к образцу добавляют гуанидинтиоцианат, в результате чего все соединения денатурируют кроме ДНК, которая в дальнейшем связывается с силикой, что позволяет получить доастаточно читую молекулу из малоко количества исследуемого образца
   
2. 
   ионообменной смолы: метод предполагает применение лизирующего буфера с длительной инкубацией при температуре 70˚С, с последующим добавлением ионообменной смолы (Cheleх 100) и денатурацией при температуре 99˚С;
   
3. 
   магнитных частиц: метод заключается в том, что в исследуемый образец добавляются лизирующий буфер и магнитные шарики, которые в процессе работы фиксируют специальным магнитным штативом. Шарики связывают выделившуюся ДНК, а в процессе очищения происходит вымывание оставшихся клеточных элементов. Завершающим шагом становится элюирование молекулы низко солевым буфером.
   
4. 
   бумажных фильтров для исследования применяется специальная бумага (целлюлозный фильтр), которая пропитана сильными буферами, связывающими нуклеиновые кислоты, денатурируя при этом белки. Кислоты защищены фильтром от ультрафиолета и нуклеаз;
   
5. 
   гель-фильтрации: метод позволяет быстро разделить молекулы в соответствии с их размерами. Сам гель сформирован в виде гранул, расположенных поперечно, напоминая собою трёхмерную, молекулярную сетку или сито. В момент пропускания материала через колонку, наполненную этим гелием, происходит разделение веществ. После чего проводится очистка этилом или фенолом;
   
6. 
   органических растворителей: один из самых первых методов, который основан на применении смеси фенол-хлороформа. Достаточно токсичен. В настоящее время применяется для получения ДНК из трудно-выделяемых объектов – костная ткань, зубы;
   
7. 
   микроцентрифужных колонок.
   

---

Рассмотрим наиболее часто используемые методики выделения нуклеиновых кислот.
ВЫДЕЛЕНИЕ ФЕНОЛ-ХЛОРОФОРМОМ



Рис. 1. Протокол выделения фенол-хлороформным методом.

Впервые данный метод был применен в 1967 года, и является одним из самых распространённых способов выделения нуклеиновых кислот.

Суть методики: получаемый клеточный лизат после разрушения тканей протеиназой К и SDS буфером, смешивая с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в пропорции 25:24:1 с последующим центрифугированием смеси, дает разделение раствора на две фазы: водную и органическую, причем все липиды и жиры находятся в органической (нижней) фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной (верхней) фазе. Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Если раствор будет иметь низкий pH, то ДНК перейдёт в органическую фазу, а РНК останется в водной фазе, что позволяет выделять РНК отдельно от ДНК.
ВЫДЕЛЕНИЕ НА СПИН-КОЛОНКАХ



Рис. 2. Протокола выделения на спин-колонках.

Выделения на спин-колонках (спин-basket) - усовершенствованный метод экстракции на частичках силики, предложенный американскими учёными в 1979 году. Принцип метода: в щелочных условиях и при повышенных концентрациях соли ДНК связывается с силикатами, что позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики со связанной ДНК. пин-basket сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на него и последующем центрифугировании на малых оборотах центрифуги ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё. Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца, путем переворачивания спин-basketвверх дном и центрифугирования.
ВЫДЕЛЕНИЕ НА МАГНИТНЫХ ЧАСТИЦАХ

---

Рис. 3.Протокола выделения на магнитных частицах.

В основе данного метода лежит получение лизата классическим способом, но с добавлением магнитных частиц. Принцип метода: выделенная нуклеиновая кислота связывается с веществом, покрывающим магнитные частицы (целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др.). После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют (Рис.3).
ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ТЕМПЕРАТУРНО-ЗАВИСИМОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ



Рис. 4. Протокол ферментативного температурно-зависимого выделения.
Практически все способы выделения основаны на первом этапе – получение лизата, используя протеиназу К и SDS, которые разрушают клеточные стенки и высвобождают нуклеиновые кислоты. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Однако не все образцы поддаются простому лизису, и в таком случае используют более сложные лизирующие составы.

Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку.

MicroGEM предложил новую методику, которая позволяет сократить время выделения нуклеиновых кислот, благодаря применению термофильной протеиназы EA1 вместе с мезофильными гидролазами.

Процесс ферментативного температурно-зависимого выделения начинается со смешивания буфера и ферментов с образцом. При последующей инкубации при комнатной температуре гидролазы деградируют клеточные стенки. После этого пробирку нагревают до 75°C, что активирует работу протеиназы EA1, которая разрушает белки и высвобождает нуклеиновые кислоты. Последующее нагревание до 95°C инактивирует EA1 (Рис.4).
ВЫДЕЛЕНИЕ с помощью ионообменных смол
Экстракция ДНК с помощью ионообменной смолы. Метод основан на применении ионообменников типа Chelex.

---

Секвенирование ДНК — экспериментальный метод определения последовательного расположения оснований нуклеиновых кислот (A, T, G и C) в полинуклеотиде, кодирующем различные белки, которые функционируют в живой клетке

Ионообменные смолы собирают примеси затрудняющие реакции, а не ДНК. Смола Chelex является сополимером стирола с дивинилбензолом, содержащим иминодиацетатные группы, связывающие поливалентные ионы металлов и относится к одному из старейших методов очистки ДНК. Данная методика включает две стадии: первая стадия - кипячение образца, вследствие этого происходит распад клеточной стенки, нуклеиновые кислоты попадают в раствор; вторая - на ионообменнике происходит сорбция примесей.
Конечной целью выделения нуклеиновых кислот является их секвенирование - определение их аминокислотной или нуклеотидной последовательности. Секвенирование ДНК — метод определения последовательного расположения оснований нуклеиновых кислот (A, T, G и C) в полинуклеотиде, кодирующем различные белки, которые функционируют в живой клетке.

В результате секвенирования получают описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. В результате секвенирования перекрывающихся участков ДНК получают последовательности участков генов, целых генов, тотальной мРНК и полных геномов организмов.

Выделяют три поколения секвенирования:

1. 
   Технологии метода химической деградации, предложенные Максамом и Гилбертом, метод дидезокси-терминации цепи, разработанный командой Sanger в 1977 г., и автоматическое секвенирование с помеченной флуоресценцией в 1990-х гг. вместе сформировали первое поколение секвенирования (FGS).
   
2. 
   Секвенирование второго поколения (SGS) или секвенирование следующего поколения (NGS) относится к высокопроизводительным технологиям секвенирования ДНК, которые могут секвенировать миллионы или миллиарды нитей ДНК. При этом процесс определения последовательности происходит с использованием ферментативной репликации или амплификации, обеспечивающей значительную пропускную способность и многократное секвенирование целевых областей.
   
3. 
   Секвенирование третьего поколения (TGS) характеризуется путем добавления нуклеотидов по одному для получения длинных и точных результатов секвенирования, в то время как технология амплификации не используется. Одноклеточное секвенирование также характерно для технологии TGS.
   

---

2. 
   Выполните практическую часть работы. Записать в тетрадь ход работы. После описания каждого опыта объяснить полученные результаты.
   

Реакции на компоненты нуклеиновых кислот могут применяться для их идентификации и количественного анализа в биохимических исследованиях, а в фармации - для контроля качества препаратов нуклеотидной природы.

Опыт 1. Кислотный гидролиз нуклеиновых кислот

Для изучения состава нуклеиновых кислот проводят кислотный гидролиз дрожжей в присутствии серной кислоты. При продолжительном гидролизе нуклеиновые кислоты распадаются на мононуклеотиды, которые в свою очередь гидролизуются на пуриновые или пиримидиновые основания, пентозу и фосфорную кислоту.

Исследуемый материал: дрожжи.

Реактивы: 10%-ный раствор H₂SO₄, концентрированный NH₃, 1%-ный раствор AgNO₃, молибденовый реактив, концентрированная H₂SO₄, тимол.

Оборудование: круглодонная колба с воздушным холодильником, воронка с фильтром, мерный цилиндр, пробирки.

Ход работы.

Помещают 1 г пекарских дрожжей в круглодонную колбу на 100 мл, добавляют 20 мл 10%-го раствора серной кислоты и 20 мл дистиллированной воды. Колбу закрывают пробкой с длинной стеклянной трубкой и кипятят под тягой в течение часа на асбестовой сетке при слабом нагревании. Через час после начала кипения нагревание жидкости прекращают, дают ей остыть, переносят в цилиндр, доводят водой до первоначального объема и фильтруют. С фильтратом проделывают качественные реакции на составные части нуклеиновых кислот:

Опыт 1.1. Серебряная проба на пуриновые основания

Метод основан на способности пуриновых оснований образовывать с аммиачным раствором нитрата серебра (АgNO₃) осадок серебряных солей пуриновых оснований (аденина, гуанина), окрашенных в светло-коричневый цвет:



Ход работы.

Нейтрализуют 10 капель гидролизата 1 каплей концентрированного аммиака и добавляют 5 капель 1%-го раствора азотнокислого серебра. Через 3-5 мин выпадает небольшой бурый осадок серебряных производных пуриновых оснований.

---

Смотрите также файлы

• Философия смерти 2чс18 Осипов Виктор.pptx

• .docx

• Система питьевой и отработанной воды.docx

• Основные средства управления полетом.docx

• 1. Проанализируйте материалы занятия. Создайте таблицу и перечислите основные этапы развития психологии в ее разделах. Охарактеризуйте в таблице кратко каждый этап.docx