Опыт 1.2. Качественные реакции на пентозы

1.2.1.Дифениламиновая проба (реакция Дише)

Метод основан на способности дезоксирибозы ДНК образовывать в реакции с дифениламином соединения синего цвета при нагревании в среде, содержащей смесь ледяной уксусной кислоты и концентрированной серной кислоты. С рибозой РНК аналогичная реакция дает зеленое окрашивание.

Ход работы.

Для приготовления дифениламинового реактива 1 г дифениланилина растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты (СН₃СO₂Н) и к полученному раствору добавляют 2,75 мл концентрированной серной кислоты (Н₂SO₄).

К 10 каплям гидролизата нуклеопротеидов дрожжей приливают 0,5 - 1 мл дифениламинового реактива. Содержимое пробирки перемешивают и нагревают на водяной бане в течение 15 - 20 минут. Отмечают характерное окрашивание раствора.

1.2.2. Проба Троммера

Эта проба, как и две последующие, основана на способности рибозы и 2-дезоксирибозы, имеющих свободный гликозидный гидроксил, восстанавливать в щелочной среде окисные формы металлов (Сu, Fе, Вi) до закисных, а закисные - до свободного состояния. Сахара же в этих условиях дают различные продукты окисления.

Ход работы.

Основана проба Троммера на указанных ниже реакциях.

1. При добавлении водного раствора гидроксида натрия (NаОН) к раствору сульфата меди (II) - СuSO₄ образуется осадок гидроксида меди (II) - Сu(ОН)₂ синего цвета:



2. При нагревании в присутствии восстанавливающих сахаров (рибозы, 2-дезоксирибозы) гидроксид меди (II) - Сu(ОН)₂ восстанавливается до гидроксида меди (I) - СuОН (желтый осадок), затем до Сu₂O - оксида меди (I), и в конечном результате образуется кирпично-красный осадок.



Избыток сульфата меди (II) - СuSO₄ мешает реакции, так как ведет к образованию большого количества Сu(ОН)₂ - гидроксида меди (II), который при нагревании распадается с образованием черного осадка СuО - оксида меди:



К 5 каплям гидролизата дрожжей добавляют 5 капель 30 % раствора гидроксида натрия (NаОН) и несколько капель 7 % раствора сульфата меди (II) - СuSO₄ до появления неисчезающей мути Сu(OН)

---

гидроксида меди (II). При нагревании до кипения выпадает желтый осадок гидроксида меди (I) - СuОН ИЛИ кирппчно- красный осадок оксида меди (I) - Сu₂O.

1.2.3. Проба Феллинга

Ход работы.

Проба Феллинга является модификацией пробы Троммера. В ней используется реактив Феллинга, для приготовления которого в пробирке смешивают 5 капель 7 % раствора сульфата меди (II) - СUSO₄ и 5 капель раствора сегнетовой соли (345 г KNaC₄H₄O₆ • 4Н₂O - тетрагидрата двойной натриевой-калиевой соли винной кислоты растворяют в дистиллированной воде), добавляют 140 г гидроксида натрия (NаОН) и доводят водой в мерной колбе до 1 л.

К реактиву Феллинга добавляют 5 - 7 капель гидролизата дрожжей, перемешивают и нагревают до кипения. Наблюдают выпадение окрашенного осадка.

1.2.4. Реакция Толленса

В отличие от двух предыдущих реакций реакция Толленса является специфичной для пентоз. Она обусловлена взаимодействием флороглюцина с фурфуролом, образующимся из пентозы при нагревании с соляной кислотой (НСI). При этом получается продукт конденсации красного цвета.



Ход работы.

В пробирку вносят 5 - 7 капель гидролизата дрожжей, 2 - 3 капли 0,5 % раствора флороглюцина в концентрированной соляной кислоте (НСI) и кипятят в течение 1 минуты. Наблюдают за изменением окраски раствора.

1.2.5. Реакция Молиша

Ход работы.

В пробирку вносят 10 капель гидролизата дрожжей, добавляют 3 капли 1 % раствора тимола, затем по стенке пробирки (осторожно!) добавляют 20 капель концентрированной соляной кислоты (НСI) и кипятят в течение 1 минуты. Наблюдают за изменением окраски раствора.
Опыт 1.3. Качественные реакции на фосфорную кислоту

1.3.1. Молибденовая проба на фосфорную кислоту

Ход работы.

Для приготовления молибденового реактива в 100 мл дистиллированной воды растворяют 7,5 г молибдата аммония - (NН₄)₂МоO₄ и добавляют 100 мл 32 % раствора азотной кислоты (НNО₃) плотностью 1,2 г/см³.

В пробирку вносят 5 капель гидролизата дрожжей, добавляют 10-20 капель молибденового реактива и кипятят в течение нескольких минут. При охлаждении пробирки под струей холодной воды выпадает кристаллический осадок фосфорной соли молибдата аммония лимонно-желтого цвета:

---

3. 
   Решение задач по теме «Нуклеиновые кислоты»
   

Необходимые пояснения:

• 
  относительная молекулярная масса одного нуклеотида принимается за 345 г/моль
  
• 
  молекулярная масса одной аминокислоты – 110-120 г/моль
  
• 
  расстояние между нуклеотидами в цепи молекулы ДНК (= длина одного нуклеотида) - 0, 34 нм
  
• 
  комплементарность нуклеотидов: А=Т; Г=Ц
  
• 
  правила Чаргаффа:
  

1. 
   ∑(А) = ∑(Т)
   
2. 
   ∑(Г) = ∑(Ц)
   
3. 
   ∑(А+Г) = ∑(Т+Ц)
   

• 
  цепи ДНК удерживаются водородными связями, которые образуются между комплементарными азотистыми основаниями: аденин с тимином соединяются двумя водородными связями, а гуанин с цитозином - тремя.
  

Пример 1. На фрагменте одной нити ДНК нуклеотиды расположены в последовательности: А-А-Г-Т-Ц-Т-А-Ц-Г-Т-А-Т.

Определите процентное содержание всех нуклеотидов в

этом гене и его длину.

Решение:

1) достраиваем вторую нить (по принципу комплементарности)

А-А-Г-Т-Ц-Т-А-Ц-Г-Т-А-Т

Т-Т-Ц-А-Г-А-Т-Г-Ц-А-Т-А

2) ∑(А +Т+Ц+Г)= 24, из них ∑(А) = 8 = ∑(Т)

24 – 100%

8 – х % отсюда: х = 33,4%

3) ∑(А +Т+Ц+Г)= 24, из них ∑(Г) = 4 = ∑(Ц)

24 – 100%

4 – х% отсюда: х = 16,6%

4) молекула ДНК двуцепочечная, поэтому длина гена равна длине одной цепи: 12 • 0,34 = 4,08 (нм)

Пример2.В молекуле ДНК на долю цитидиловых нуклеотидов приходится 18%.Определите процентное содержание других нуклеотидов в этой ДНК.

Решение:

1) Ц – 18% => Г – 18%, т.к. ∑(Г) = ∑(Ц)

2) На долю А+Т приходится 100% - (18% +18%)=64%, т.е. по 32%

Пример 3. В молекуле ДНК обнаружено 880 гуаниловых нуклеотидов, которые

составляют 22% от общего числа нуклеотидов в этой ДНК. Определите:

а) сколько других нуклеотидов в этой ДНК?

б) какова длина этого фрагмента?

Решение:

1) ∑(Г)= ∑(Ц)= 880 (это 22%)

На долю других нуклеотидов приходится 100% - (22%+22%)= 56%, т.е. по 28%

Для вычисления количества этих нуклеотидов составляем

пропорцию 22% - 880

28% - х отсюда: х = 1120

2) для определения длины ДНК нужно узнать, сколько всего нуклеотидов содержится в 1

цепи:

(880 + 880 + 1120 + 1120) : 2 = 2000 (нукл.)

2000 • 0,34 = 680 (нм)

Пример 4. Дана молекула ДНК с относительной молекулярной массой 69000, из них 8625 приходится на долю адениловых нуклеотидов. Найдите количество всех нуклеотидов в этой ДНК. Определите длину этого фрагмента.

---

Решение:

1) Т.к. относительная молекулярная масса одного нуклеотида принимается за 345 г/моль, то

69000 : 345 = 200 (нуклеотидов в ДНК)

8625 : 345 = 25 (адениловых нуклеотидов в этой ДНК)

2) ∑(Г+Ц) = 200 – (25+25)= 150, т.е. их по 75.

3) 200 нуклеотидов в двух цепях => в одной – 100.

100 · 0,34 = 34 (нм)

Пример 5. Две цепи ДНК удерживаются друг против друга водородными связями. Определите число двойных и тройных водородных связей этой цепи ДНК, если известно, что нуклеотидов с тимином – 18, с цитозином – 32 в обеих цепях ДНК.

Решение:

1) Тимин с аденином соединяются двумя водородными связями. Если нуклеотидов с тимином – 18, то адениловых нуклеотидов тоже 18. Следовательно, между ними возникает 18 двойных водородных связей.

2) Цитозин с гуанином соединяются тремя водородными связями. Если нуклеотидов с цитозином – 32, то с гуанином тоже будет 32. Значит между ними возникает 32 тройные водородные связи.
Выполните решение задач самостоятельно: решение оформите в терадях.

1. На фрагменте одной нити ДНК нуклеотиды расположены в последовательности: А–А–Г–Т–Ц–Т–А–Ц–Г–Т–А–Т. Определите процентное содержание всех нуклеотидов в этом фрагменте ДНК и длину гена.

2. На фрагменте одной цепи ДНК нуклеотиды расположены в следующем порядке: Г-Г-Ц-Ц-А-Т-Т-Т-Г-Ц-А-Т-А-Ц-Г-Т-… Определите структуру второй цепи ДНК и определите длину этого фрагмента ДНК.

3. Фрагмент первой цепи ДНК имеет следующий нуклеотидный состав:

Г–Г-Г-Ц-А-Т-А-А-Ц-Г-Ц-Т. Определите порядок чередования нуклеотидов во второй цепи. Какова длина данного фрагмента молекулы ДНК? Определите процент содержания каждого нуклеотида в данном фрагменте.

4. В молекуле ДНК цитозиновый нуклеотид составляет 20% от общего количества нуклеотидов. Определите, сколько остальных типов нуклеотидов в этой молекуле.

5. В одной молекуле ДНК нуклеотиды с цитозином составляют 11% от общего числа нуклеотидов. Определите количество (в %) других нуклеотидов в молекуле ДНК.

8. Определите длину фрагмента ДНК, если ее цепочка состоит из 350 гуаниновых и 300 тиминовых нуклеотидов.

9.Участок молекулы ДНК имеет следующую структуру: ЦЦАТТАГГЦЦААГГТЦГТАТА. Определите структуру второй цепи ДНК и число тройных водородных связей в этом участке молекулы ДНК.

10. Молекулярная масса молекулы ДНК составляет 149730. Из них 42435 приходится на долю гуаниловых нуклеотидов. Найдите количество всех нуклеотидов в этой ДНК. Определите длину этого фрагмента ДНК.

---

Контрольные вопросы:

1. 
   Установите соответствие:
   

2. 
   Установите соотвествие:
   

3. 
   Охарактеризуйте основные методы выделения нуклеиновых кислот.
   
4. 
   Дайте определение понятию «секвенирование». В чем суть данного метода?
   
5. 
   С какой целью проводят секвенирование?
   

Рекомендуемая литература

1. Материал лекций.

2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 2008.-528 с.

3. Тюкавкина Н.А., Бауков Ю.И. Биоорганическая химия. – М.: Медицина, 2008. – 542 с.

4. Филиппович Ю.Б.Основы биохимии. - М.: Высшая школа, 1999. – 506 с.

---

Смотрите также файлы

• Философия смерти 2чс18 Осипов Виктор.pptx

• .docx

• Система питьевой и отработанной воды.docx

• Основные средства управления полетом.docx

• 1. Проанализируйте материалы занятия. Создайте таблицу и перечислите основные этапы развития психологии в ее разделах. Охарактеризуйте в таблице кратко каждый этап.docx