ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 06.04.2021
Просмотров: 572
Скачиваний: 1
4
Место
проведения
работы
Работа
выполнена
в
лаборатории
микробиологии
антропогенных
мест
обитания
Федерального
государственного
бюджетного
учреждения
науки
Институт
микробиологии
им
.
С
.
Н
.
Виноградского
Российской
академии
наук
.
Молекулярно
-
биологические
исследования
проводили
в
центре
коллективного
пользования
ИНМИ
РАН
,
в
Центре
«
Биоинженерия
»
РАН
и
на
кафедре
прикладной
химии
и
микробиологии
факультета
микробиологии
Университета
г
.
Хельсинки
(
Финляндия
).
Благодарности
Автор
выражает
глубокую
признательность
своему
научному
руководителю
к
.
б
.
н
.
С
.
Н
.
Паршиной
за
научное
руководство
и
помощь
в
работе
,
благодарит
сотрудников
ИНМИ
РАН
д
.
б
.
н
.,
зав
.
лабораторией
А
.
Н
.
Ножевникову
,
к
.
б
.
н
.
А
.
Ю
.
Каллистову
,
к
.
б
.
н
.
Е
.
Н
.
Деткову
,
к
.
б
.
н
.
А
.
К
.
Кизилову
,
Н
.
А
.
Кострикину
,
сотрудников
кабинета
газохроматографического
анализа
,
сотрудников
центра
коллективного
пользования
,
сотрудников
Центра
«
Биоинженерия
»
РАН
за
практическую
помощь
и
ценные
советы
.
Объем
и
структура
диссертации
Материалы
диссертации
изложены
на
134
страницах
машинописного
текста
и
включают
35
рисунков
и
12
таблиц
.
Диссертация
состоит
из
введения
,
обзора
литературы
,
экспериментальной
части
,
содержащей
методы
,
результаты
исследования
,
обсуждение
,
заключение
,
выводы
и
список
литературы
,
состоящий
из
220
наименований
.
СОДЕРЖАНИЕ
РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ
И
МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами
исследования
служили
(1)
адаптированная
к
низкой
температуре
гранулированная
метаногенная
микробная
биомасса
,
полученная
из
лабораторного
двустадийного
EGSB
реактора
(
Университет
Вагенингена
,
Нидерланды
),
обрабатывавшего
модельную
сточную
воду
с
летучими
жирными
кислотами
-
ацетатом
,
пропионатом
и
бутиратом
в
качестве
источника
углерода
и
энергии
при
температуре
4–
12°
С
(Rebac et al., 1995; Lettinga et al., 1999); (2)
накопительные
культуры
двух
морфотипов
метаносарцин
,
выделенных
из
жидких
стоков
свинофермы
,
расположенной
в
северной
части
Крымской
области
(
поселок
Нижнегорск
,
Украина
).
Пробы
для
выделения
отбирали
со
дна
навозохранилища
,
где
температура
была
ниже
10°
С
.
5
Синтрофные
консорциумы
,
накопительные
и
чистые
культуры
микроорганизмов
культивировали
с
использованием
минеральных
сред
,
описанных
в
публикациях
(1, 2),
с
добавлением
дрожжевого
экстракта
(0.2–0.5
г
/
л
)
и
(
при
работе
с
чистыми
культурами
метаногенов
)
казаминовых
кислот
(5–10
г
/
л
).
Для
работы
с
синтрофными
консорциумами
в
качестве
субстратов
использовали
раздельно
пропионат
и
бутират
(10–20
ммоль
/
л
).
Для
определения
спектра
субстратов
,
используемых
чистыми
культурами
метаногенов
,
применяли
триметиламин
,
диметиламин
,
монометиламин
,
метанол
,
формиат
,
ацетат
,
лактат
,
бутанол
,
этанол
,
ацетон
,
бетаин
,
кротонат
,
пируват
в
концентрации
10–20
ммоль
/
л
и
смесь
водорода
и
углекислого
газа
(80:20).
Культивирование
проводили
при
температуре
1, 5, 10, 18, 21,
25, 30, 35, 40, 50°
С
,
в
присутствии
0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6
М
NaCl
и
в
интервале
рН
от
4.0
до
10.0.
Выделение
накопительных
и
чистых
культур
метаногенов
проводили
методом
серийных
разведений
,
получением
колоний
по
методу
roll-tubes (
в
пробирках
Хангейта
или
в
пенициллиновых
флаконах
с
тонким
слоем
2%
агаризованной
среды
),
посевом
на
разные
субстраты
,
культивированием
при
разных
температурах
.
При
выделении
использовали
антибиотики
:
ванкомицин
(100–200
мг
/
л
),
пенициллин
(2
мг
/
л
),
стрептомицин
(200
мг
/
л
),
канамицин
(100
мг
/
л
),
хлорамфеникол
(100
мг
/
л
),
ампициллин
(1
г
/
л
),
циклосерин
(100
мг
/
л
),
эритромицин
(100
мг
/
л
),
рифампицин
(100
мг
/
л
).
О
чистоте
культуры
судили
по
результатам
микроскопирования
,
отсутствию
роста
на
глюкозо
-
пептонной
среде
,
а
также
с
помощью
молекулярно
-
биологических
методов
(
ПЦР
-
амплификация
с
бактериальными
и
архейными
праймерами
и
секвенирование
).
Для
ДНК
-
ДНК
гибридизации
использовали
типовые
штаммы
Methanospirillum hungatei
JF1
T
и
Methanosarcina lacustris
ZS
T
.
Микроскопические
методы
исследования
Микроскопирование
проводили
с
помощью
микроскопов
МБИ
-3
и
Axiolmager D1
(CarlZeiss,
Германия
).
Электронные
фотографии
получали
на
микроскопе
JEOL 100C
XII (
Япония
).
Газожидкостная
хроматография
Летучие
жирные
кислоты
определяли
методом
газоадсорбционной
хроматографии
на
хроматографе
Chrom 5 (
Прага
,
Чехия
)
с
пламенно
-
ионизационным
детектором
.
В
качестве
сорбента
использовали
Хромосорб
-101.
Температура
детектора
и
испарителя
–
170
и
230°
С
соответственно
.
Расходы
водорода
и
воздуха
составляли
30
и
300
мл
/
мин
соответственно
.
Расход
газа
-
носителя
(
аргона
) – 40
мл
/
мин
.
Пробу
культуральной
6
жидкости
предварительно
центрифугировали
(10000
об
/
мин
, 10
мин
).
Супернатант
подкисляли
10%-
й
Н
3
РО
4
до
рН
2.
Анализ
газов
проводили
на
хроматографе
ГХ
3700 (
сорбент
Porapak Q)
и
Кристалл
5000.1 (
сорбент
Хромосорб
102)
с
пламенно
-
ионизационным
детектором
(
Россия
).
Температура
колонок
–
комнатная
;
газ
-
носитель
–
аргон
,
расход
газа
– 40
мл
/
мин
.
Ток
накала
нити
80
мА
.
Использовали
стеклянные
колонки
длиной
1.2
м
и
внутренним
диаметром
– 3
мм
.
Молекулярно
-
биологические
методы
Выделение
ДНК
чистых
культур
,
ПЦР
-
амплификацию
генов
16S
рРНК
и
mcrA
,
гель
-
электрофорез
,
очистку
продуктов
ПЦР
,
секвенирование
,
определение
содержания
Г
+
Ц
пар
оснований
в
ДНК
,
ДНК
-
ДНК
гибридизацию
проводили
,
как
описано
в
публикации
(2).
При
выделении
ДНК
метаносарцин
биомассу
дополнительно
растирали
в
ступке
с
жидким
азотом
2–4
раза
.
Выделение
тотальной
ДНК
синтрофного
консорциума
проводили
методом
,
основанным
на
использовании
гексадецилтриметиламмоний
бромида
(Wilson et al.,
1989).
Амплификацию
генов
16S
рРНК
чистых
культур
проводили
с
использованием
универсальных
бактериальных
8-27F/1492R
и
универсальных
архейных
8fa/1492R
праймеров
.
ДНК
-
фрагменты
,
полученные
при
амплификации
образцов
ДНК
с
бактериальными
праймерами
GC984F/1492R
и
архейными
праймерами
GCArch3F/519R,
разделяли
методом
денатурирующего
градиентного
гель
-
электрофореза
(
ДГГЭ
)
в
6%
акриламидном
геле
,
с
содержанием
линейного
градиента
(
от
30
до
60%)
ДНК
-
денатурантов
(
смесь
мочевины
и
формамида
)
по
стандартной
методике
(Muyzer et al., 1993).
Последующую
амплификацию
проводили
с
бактериальными
праймерами
984F/1492R
и
архейными
праймерами
Arch3F/519R.
Ген
mcr
A
амплифицировали
с
использованием
праймеров
MLF/MLR, mlas/mcrA-rev.
Продукты
амплификации
секвенировали
по
методу
Сэнгера
(Sanger et al., 1977)
с
помощью
набора
реактивов
Big Dye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Inc., USA)
на
генетическом
анализаторе
ABI PRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc., USA).
Обработку
полученных
хроматограмм
проводили
с
помощью
программы
Chromas,
версия
1.45.
Сравнительный
анализ
полученных
последовательностей
с
последовательностями
из
базы
данных
GenBank
проводили
с
помощью
программы
NCBI Blast
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
Редактирование
последовательностей
проводили
с
помощью
редактора
BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html).
Построение
филогенетических
деревьев
проводили
с
помощью
программы
Geneious Pro
(v 6.1, Biomatters, New Zealand).
7
РЕЗУЛЬТАТЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ
1.
Исследование
метаболической
устойчивости
биомассы
к
изменениям
температуры
культивирования
Ранее
было
показано
,
что
продуктивность
разложения
ЛЖК
гранулированной
биомассой
низкотемпературного
анаэробного
биореактора
(4–12°
С
),
использованной
для
наших
исследований
,
была
сравнима
с
продуктивностью
мезофильного
реактора
(Lettinga et al., 1999).
В
природных
условиях
или
при
эксплуатации
биогазовых
установок
,
в
том
числе
низкотемпературных
,
температура
культивирования
может
меняться
.
Поэтому
было
важно
исследовать
степень
метаболической
устойчивости
психроактивного
микробного
сообщества
к
временному
повышению
(30°
С
)
или
вторичному
понижению
(
до
10°
С
)
температуры
при
периодическом
культивировании
(
Паршина
с
соавт
., 2011).
Биомассу
из
ферментера
в
течение
нескольких
лет
хранили
в
стеклянном
флаконе
объемом
140
мл
при
10°
С
.
Для
данного
эксперимента
биомассу
гомогенизировали
в
стеклянной
ступке
под
током
азота
для
более
равномерного
внесения
во
флаконы
с
питательной
средой
с
пропионатом
(10
ммоль
/
л
)
и
отдельно
с
бутиратом
(10
ммоль
/
л
).
Инкубацию
проводили
при
10°
С
и
30°
С
.
При
температуре
30°
С
флаконы
находились
разные
промежутки
времени
: 48
суток
, 84
суток
и
150
суток
с
дальнейшим
возвращением
на
температуру
10°
С
.
В
результате
проведенного
исследования
было
показано
,
что
инкубирование
биомассы
в
течение
относительно
короткого
времени
(48
суток
)
при
температуре
30°
С
не
ухудшало
её
активность
при
10°
С
.
Однако
долговременное
культивирование
биомассы
при
30°
С
приводило
к
её
адаптации
к
мезофильным
условиям
и
высокой
продуктивности
разложения
органического
вещества
при
этой
температуре
.
Полученные
результаты
свидетельствует
о
присутствии
в
сообществе
как
мезофильных
,
так
и
психроактивных
микроорганизмов
.
При
культивировании
более
двух
-
трех
месяцев
при
30°
С
мезофильные
микроорганизмы
,
вероятно
,
замещают
психроактивные
.
2.
Получение
синтрофных
метаногенных
консорциумов
на
пропионате
и
бутирате
Биомассу
из
анаэробного
биореактора
в
течение
нескольких
лет
поддерживали
методом
последовательных
пересевов
при
10°
С
на
средах
с
пропионатом
и
бутиратом
раздельно
,
чётко
соблюдая
линию
каждого
субстрата
.
В
результате
на
каждом
из
субстратов
были
получены
метаногенные
консорциумы
.
Микроскопирование
8
обнаруживало
присутствие
в
каждом
из
них
5-7
морфологически
различных
микроорганизмов
(
рис
. 1
а
,
б
).
а
б
Несмотря
на
культивирование
в
периодических
условиях
,
многократные
пересевы
и
,
видимо
,
связанное
с
этим
постепенное
элиминирование
части
микроорганизмов
,
не
принимавших
непосредственного
участия
в
синтрофном
окислении
,
микроорганизмы
консорциумов
не
потеряли
способность
к
образованию
агрегатов
,
что
является
важным
свойством
для
их
сбалансированного
функционирования
(
рис
. 1
а
,
б
).
Консорциумы
,
развивавшиеся
на
средах
с
бутиратом
и
пропионатом
,
кроме
бактерий
,
содержали
клетки
в
форме
длинных
изогнутых
нитей
,
морфологически
сходные
с
ацетокластическим
метаногеном
Methanosaeta,
и
более
короткие
изогнутые
палочки
,
морфологически
сходные
с
Methanospirillum
,
причем
на
бутирате
было
больше
Methanosaeta
sp.,
а
на
пропионате
–
Methanospirillum
sp. (
рис
. 1
а
,
б
).
В
агрегатах
также
были
обнаружены
клетки
метаногена
,
образующего
тетрады
из
кокковидных
клеток
,
морфологически
сходного
с
Methanomethylovorans
sp. (
на
бутирате
в
большем
количестве
,
чем
на
пропионате
) (
рис
. 1
б
).
3.
Исследование
влияния
температуры
на
потребление
пропионата
и
бутирата
метаногенными
консорциумами
Пропионат
-
и
бутират
-
окисляющие
консорциумы
культивировали
при
температуре
10, 20, 30
и
40°
С
.
Показано
,
что
пропионат
не
потребляется
синтрофным
консорциумом
при
30
и
40°
С
.
Оптимальной
температурой
для
потребления
пропионата
является
температура
20°
С
(
рис
. 2
а
).
Инкубирование
при
10°
С
приводило
к
окислению
пропионата
,
но
с
временным
накоплением
ацетата
(
рис
. 2
б
).
Пропионат
-
окисляющий
консорциум
потерял
свою
способность
к
росту
при
30°
С
,
очевидно
,
из
-
за
многократных
пересевов
при
температуре
10°
С
,
приведших
к
низкотемпературной
селекции
психроактивных
микроорганизмов
.
Рис
. 1.
Микрофотография
пропионат
-
окисляющего
(
а
)
и
бутират
-
окисляющего
(
б
)
консорциумов
.
Шкала
10
мкм
.