ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 06.04.2021
Просмотров: 578
Скачиваний: 1
14
этаноле
,
бутаноле
и
метиламинах
(10
ммоль
/
л
)
не
растет
.
На
формиате
(10
ммоль
/
л
)
наблюдается
очень
слабый
рост
.
Ацетат
(2
ммоль
/
л
)
и
дрожжевой
экстракт
(1
г
/
л
)
оказывают
стимулирующее
действие
на
рост
штамма
.
Штамм
Pt1
Т
чувствителен
к
циклосерину
и
канамицину
,
однако
резистентен
к
пенициллину
,
ампициллину
,
эритромицину
,
ванкомицину
и
рифампицину
.
Филогенетический
анализ
,
основанный
на
сравнении
генов
16S
рРНК
исследуемого
штамма
и
родственных
организмов
,
показал
низкий
уровень
сходства
с
Methanospirillum hungatei
JF1
T
(97.5%)
и
еще
более
низкий
уровень
сходства
с
Methanospirillum lacunae
Ki8-1
T
(94%) (
рис
.7).
Рис
. 7.
Филогенетическое
положение
штамма
Pt1
Т
на
основании
сравнения
нуклеотидных
последовательностей
гена
16S
рРНК
методом
ближайших
соседей
.
Цифрами
показаны
значения
индекса
“bootstrap”
более
50%.
В
корне
дерева
Methanobacteria
(
не
показано
).
Анализ
,
основанный
на
сравнении
нуклеотидных
последовательностей
гена
mcr
A,
также
показал
низкий
уровень
сходства
с
Methanospirillum hungatei
JF1
T
(91%)
и
с
Methanospirillum lacunae
Ki8-1
T
(86%).
Содержание
Г
+
Ц
пар
оснований
в
ДНК
40
мол
%.
Уровень
ДНК
-
ДНК
гибридизации
штаммов
Methanospirillum
stamsii
Pt1
Т
и
Methanospirillum hungatei
JF1
T
составляет
39%.
Совокупность
физиологических
и
молекулярно
-
биологических
характеристик
штамма
,
позволяет
отнести
выделенный
штамм
к
новому
виду
Methanospirillum stamsii
Pt1
Т
(=DSM 26304
Т
, =VKM B-2808
Т
).
Ранее
были
выделены
и
описаны
два
вида
метаногенов
,
относящихся
к
роду
Methanospirillum
:
Methanospirillum hungatei
JF1
T
(Ferry et al., 1974)
и
Methanospirillum
lacunae
Ki8-1
T
(Iino et al., 2010).
Представители
этих
видов
являются
мезофилами
и
не
растут
ниже
20°
С
(
Methanospirillum hungatei
)
и
15°
С
(
Methanospirillum lacunae
).
В
таблице
3
приведены
сравнительные
характеристики
типовых
штаммов
рода
15
Methanospirillum.
Штамм
Pt1
Т
психроактивный
–
он
имеет
более
низкий
температурный
предел
и
оптимум
роста
(
табл
. 3).
Таблица
3.
Сравнительные
характеристики
штамма
Pt1
Т
,
M. lacunae
Ki8-1
T
и
M. hungatei
JF1
T
Характеристика
Pt1
T
M. lacunae
Ki8-1
T
M. hungatei
JF1
T
Форма
клеток
искривленные
палочки
искривленные
палочки
искривленные
палочки
Ширина
клеток
(
мкм
)
0.4-0.5 0.5-0.6 0.4-0.5
Длина
клеток
(
мкм
)
7-25 11-25 7.4-10
Диапазон
температур
(°C)
5-37 15-37 25-50
Оптимум
температуры
(°C)
20-30 30 30-37
Диапазон
pH
6.0-10.0 6.0-9.5 6.5-10.0
Оптимум
pH
7.0-7.5 7.5 6.6-7.4
Диапазон
NaCl (M)
0-0.3 0-0.2 0-0.2
Оптимум
NaCl (
М
)
0 0 0
Субстраты
:
H
2
/CO
2
+
+
+
Формиат
±
+
+
Содержание
Г
+
Ц
(
мол
%)
40 (T
m
) 45.3 (HPLC) 45 (T
m
)
Источник
выделения
биомасса
реактора
почва
муниципальные
сточные
воды
6.
Выделение
и
описание
«
Methanosarcina
porcellina
»
sp. nov.
штамм
Pr1, Pr2
T
и
их
бактерии
-
спутника
Sphaerochaeta
sp. PS
Одной
из
задач
нашего
исследования
было
выделение
психроактивных
метаногенов
из
низкотемпературных
мест
обитания
.
Ранее
Т
.
Н
.
Жилина
и
Г
.
А
.
Заварзин
(1991)
выделили
из
подмосковного
болота
штамм
Methanosarcina
sp. Z-7289,
способный
расти
при
температуре
6°
С
.
Метаносарцина
росла
на
ацетате
,
но
не
использовала
Н
2
/
СО
2
.
Позже
Паршиной
и
соавторами
(1993)
были
получены
накопительные
культуры
двух
морфотипов
метаносарцин
из
жидких
стоков
свинофермы
,
хранившихся
в
навозохранилище
при
среднегодовой
температуре
ниже
10°
С
,
а
также
накопительная
культура
метаносарцины
из
донных
осадков
пресноводного
озера
.
Все
метаносарцины
были
способны
расти
при
1–5°
С
.
Психроактивная
сарцина
,
выделенная
из
донных
осадков
,
названная
Methanosarcina lacustris
(Simankova et al., 2001),
является
единственной
из
десяти
известных
видов
психроактивных
метаногенов
,
выделенной
из
пресноводного
источника
и
способной
расти
при
температуре
ниже
10°
С
на
Н
2
/
СО
2
.
На
данный
момент
ни
один
валидный
психроактивный
метаноген
не
был
выделен
из
антропогенных
мест
обитания
.
Метаносарцины
из
свиного
навоза
представляют
большой
интерес
,
так
как
были
обнаружены
в
низкотемпературном
антропогенном
месте
обитания
.
Из
накопительной
культуры
была
выделена
,
но
не
описаны
чистая
16
культура
Methanosarcina
sp.
штамм
Pr2
и
монокультура
Methanosarcina
sp.
штамм
Pr1.
В
рамках
настоящей
работы
автором
диссертации
методом
серийных
разведений
,
высевом
на
среду
с
агаром
,
пересевами
с
антибиотиками
Methanosarcina
sp.
штамм
Pr1
была
выделена
в
чистую
культуру
.
6.1.
Описание
«
Methanosarcina
porcellina
»
sp. nov. Pr2
T
и
штамма
Р
r1
Штаммы
Pr1
и
Pr2
T
растут
в
виде
молочно
-
белых
агрегатов
на
дне
флаконов
.
Надосадочная
жидкость
остается
прозрачной
.
Штамм
Pr2
Т
образует
более
крупные
агрегаты
,
чем
штамм
Pr1 (
рис
. 8
а
),
состоящие
иногда
из
нескольких
сотен
плотно
упакованных
кокковидных
клеток
неправильной
формы
(
рис
. 8
б
).
а
б
Размер
кокков
в
агрегатах
штамма
Pr1
составляет
1.5–3.5
мкм
в
диаметре
,
а
штамм
Pr2
Т
образует
кокки
0.5–1.5
мкм
в
диаметре
.
При
взбалтывании
агрегаты
легко
разрушаются
,
в
результате
чего
культуральная
жидкость
становится
тонкодисперсной
и
мутно
-
белого
оттенка
,
а
осадок
сравнительно
долго
оседает
.
При
высеве
на
агаризованную
среду
штаммы
формируют
колонии
бледно
-
желтого
цвета
.
Диаметр
колоний
штамма
Pr1
составляет
0.4–1.0
мм
,
а
штамма
Pr2
Т
- 0.5–1.5
мм
.
Оба
штамма
-
строгие
анаэробы
,
чувствительные
к
канамицину
и
хлорамфениколу
.
Штаммы
растут
на
монометиламине
,
диметиламине
,
триметиламине
,
метаноле
,
но
не
используют
формиат
,
ацетат
,
лактат
,
пируват
,
кротонат
,
бетаин
,
пропионат
,
бутират
,
этанол
, 1-
пропанол
, 2-
пропанол
, 1-
бутанол
, 2-
бутанол
.
Штамм
Pr1,
в
отличие
от
штамма
Pr2
Т
,
обладает
способностью
к
росту
на
смеси
H
2
/CO
2
.
Температурный
диапазон
метанообразования
для
штамма
Pr1
составляет
1–30°
С
,
с
оптимумом
при
21°
С
(
рис
. 9
а
).
При
температуре
1°
С
наблюдается
длинная
лаг
-
фаза
и
низкая
скорость
метанообразования
.
При
35°
С
метан
не
образуется
.
Штамм
Pr2
Т
образует
метан
в
пределах
температур
от
5
до
35°
С
,
с
оптимумом
при
25–30°
С
(
рис
. 9
б
).
При
температурах
1
и
40°
С
метанобразования
не
происходит
.
Рис
. 8.
Микрофотография
Methanosarcina
sp.
штамм
Pr1 (
а
)
и
“
Methanosarcina
porcellina”
штамм
Pr2
Т
(
б
).
Шкала
10
мкм
.
17
0
1
2
3
4
5
6
7
0
5
10 15 20 25 30 35 40
М
аксим
ал
ьн
ая
ск
ор
ос
ть
м
ет
ан
оо
бр
азо
ва
н
ия
(
мм
ол
ь
/
л
в
су
тк
и
)
Температура
(°
С
)
0
1
2
3
4
5
6
3
4
5
6
7
8
9
М
акс
им
ал
ьн
ая
ско
ро
ст
ь
м
ет
ан
ообр
аз
ов
ан
ия
(
ммо
ль
/
л
в
су
тк
и
)
рН
0
1
2
3
4
5
6
5
6
7
8
9
М
акс
им
ал
ьн
ая
ско
ро
ст
ь
м
ет
ан
ообр
аз
ов
ан
ия
(
ммо
ль
/
л
в
су
тк
и
)
рН
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0
5
10
15
20
25
30
35
40
М
аксим
ал
ьн
ая
ско
ро
ст
ь
м
ет
ано
об
ра
зо
ва
ни
я
(
мм
ол
ь
/
л
в
су
тк
и
)
Температура
(°
С
)
Штамм
Pr1
образует
метан
в
интервале
рН
от
5.5
до
7.5
с
оптимумом
рН
6.0–7.2
(
рис
. 10
а
).
Штамм
Pr2
Т
образует
метан
в
диапазоне
рН
от
6.5
до
7.5
с
оптимумом
рН
6.8–7.2 (
рис
. 10
б
).
а
б
Рис
. 9
.
Максимальные
скорости
образования
метана
штаммами
Pr1 (
а
)
и
Pr2
Т
(
б
)
при
разных
температурах
культивирования
в
средах
с
триметиламином
.
а
б
Рис
. 10
.
Максимальные
скорости
образования
метана
штаммами
Pr1 (
а
)
и
Pr2
Т
(
б
)
при
культивирования
в
средах
с
разным
значением
рН
.
Штаммы
Pr1
и
Pr2
Т
образуют
метан
при
солености
среды
менее
0.4
М
NaCl
и
0.2
М
NaCl
соответственно
.
Оптимальная
скорость
метанообразования
обоих
штаммов
наблюдается
при
0 NaCl
в
среде
.
В
сравнении
со
штаммом
Pr1,
штамм
Pr2
Т
обладает
более
узкими
диапазонами
рН
,
температуры
и
содержания
NaCl
для
роста
и
метанообразования
.
Филогенетический
анализ
нуклеотидных
последовательностей
гена
16S
рРНК
исследуемых
штаммов
показал
100%
сходства
друг
с
другом
и
99.9%
сходства
с
геном
Methanosarcina lacustris
ZS
Т
(
рис
. 11).
Анализ
последовательностей
гена
mcr
A
выделенных
штаммов
Pr1
и
Pr2
T
также
показал
100%
сходства
этих
генов
у
обоих
штаммов
между
собой
и
99.5%
сходства
с
геном
mcr
A
типового
штамма
Methanosarcina
lacustris
ZS
Т
(
подробнее
в
рукописи
).
Содержание
Г
+
Ц
пар
оснований
в
ДНК
штамма
Pr1
составляет
45.6
мол
%,
а
у
штамма
Pr2
Т
- 43.8
мол
%.
Уровень
ДНК
-
ДНК
гибридизации
штаммов
Pr1
и
Pr2
Т
с
ближайшим
родственным
микроорганизмом
Methanosarcina lacustris
ZS
Т
составляет
53
18
и
42%
сходства
с
,
соответственно
.
Уровень
ДНК
-
ДНК
гибридизации
штамма
Pr1
со
штаммом
Pr2
Т
79%.
Рис
. 11.
Филогенетическое
положение
штамма
Pr1
и
штамма
Pr2
Т
на
основании
сравнения
нуклеотидных
последовательностей
гена
16S
рРНК
методом
ближайших
соседей
.
Штамм
Methanosarcina
sp. Pr1
был
депонирован
в
международной
коллекции
(=VKM B-2807).
Штамм
Methanosarcina
sp. Pr2
Т
был
депонирован
в
международных
коллекциях
(=DSM 15218
Т
, =VKM B-2806
Т
).
Таблица
4.
Сравнительные
характеристики
штаммов
Pr1, Pr2
Т
и
M. lacustris
ZS
Т
Характеристика
Штамм
Pr1
Штамм
Pr2
Т
M. lacustris
ZS
Т
Морфология
агрегаты
кокков
агрегаты
кокков
агрегаты
кокков
Размер
кокков
(
мкм
)
1.5-3.5 0.5-1.5 1.5-3.5
Т
опт
. (°
С
)
21 25-30
25
Т
мин
. –
Т
макс
. (°
С
)
1-30 5-35 1-35
NaCl
опт
. (
М
)
0 0 0
NaCl
мин
. - NaCl
макс
. (
М
)
0-0.3 0-0.1
н
.
о
.*
рН
опт
.
6.0-7.2 6.8-7.2 7.0
pH
мин
. - pH
макс
.
5.5-7.5 6.5-7.5 4.5-8.5
Субстраты
:
Ацетат
Метиламины
Метанол
Н
2
/
СО
2
-
+
+
+
-
+
+
-
-
+
+
+
%
сходства
гена
16S
рРНК
:
M. lacustris
ZS
Т
(%)
Pr2
Т
99.9
100
99.9
100
100
-
%
сходства
по
гену
mcr
A:
M. lacustris
ZS
Т
(%)
Pr2
Т
99.5
100
99.5
100
100
-
ДНК
-
ДНК
гибридизация
c:
M. lacustris
ZS
Т
(%)
с
Pr2
Т
53
79
42
100
100
-
Содержание
Г
+
Ц
(
мол
%)
45.6 43.8 43.4
•
н
.
о
. –
не
определяли