ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 06.04.2021
Просмотров: 576
Скачиваний: 1
9
0
10
20
30
40
0
50
100
150
200 250
300
Время
(
сутки
)
Мет
ан
(
ммол
ь
/
л
)
10°
С
20°
С
30°
С
40°
С
0
10
20
30
40
0
50
100 150
200
250
300
Время
(
сутки
)
К
онце
н
тр
ац
ия
(
ммоль
/
л
)
Пропионат
Ацетат
CH4
0
10
20
30
40
0
50
100 150 200 250 300
Время
(
сутки
)
Ме
та
н
(
ммо
л
ь
/
л
)
10°
С
20°
С
30°
С
40°
С
0
10
20
30
40
0
50
100 150 200 250 300
Время
(
сутки
)
К
онце
н
тр
ац
ия
(
ммо
л
ь
/
л
)
Бутират
Ацетат
CH4
а
б
Рис
. 2.
Динамика
окисления
пропионата
и
образования
метана
консорциумом
при
разных
температурах
.
При
10, 20, 30
и
40°
С
(
а
)
и
10°
С
(
б
).
Бутират
-
окисляющий
консорциум
функционировал
в
диапазоне
температур
от
10
до
30°
С
с
оптимумом
при
20–30°
С
.
При
40°
С
окисление
бутирата
не
происходило
(
рис
.
3
а
).
Инкубирование
при
10°
С
сопровождалось
временным
накоплением
ацетата
(
рис
. 3
б
).
а
б
Рис
. 3.
Динамика
окисления
бутирата
и
образования
метана
консорциумом
при
разных
температурах
.
При
10, 20, 30
и
40°
С
(
а
).
При
температуре
10°
С
(
б
).
4.
Исследование
микробного
разнообразия
метаногенных
синтрофных
консорциумов
методом
денатурирующего
градиентного
гель
-
электрофореза
4.1.
Исследование
бактериальной
составляющей
пропионат
-
и
бутират
-
окисляющих
консорциумов
Анализ
ПЦР
-
продуктов
пропионат
-
и
бутират
-
окисляющих
консорциумов
,
после
амплификации
с
универсальными
бактериальными
праймерами
для
ДГГЭ
,
показал
наличие
5-7
полос
в
каждом
консорциуме
.
Обращало
на
себя
внимание
различное
расположение
полос
в
образцах
из
пропионат
-
и
бутират
-
окисляющих
консорциумов
,
выращенных
при
10
и
30°
С
(
рис
. 4
а
,
б
;
табл
. 1, 2).
Это
свидетельствовало
о
различной
10
таксономической
принадлежности
бактерий
,
использующих
пропионат
или
бутират
и
составляющих
психроактивный
и
мезофильный
консорциумы
.
а
БК
П
10
П
30
б
Б
10
Б
30
Путем
амплификации
генов
16S
рРНК
с
универсальными
бактериальными
праймерами
и
последующим
сиквенированием
вырезанных
после
ДГГЭ
полос
,
был
получен
ряд
последовательностей
,
близких
к
генам
16S
рРНК
известных
бактерий
–
пропионат
-
окислящей
бактерии
Smithella propionica
(97%),
бутират
-
окисляющей
бактерии
Syntrophomonas bryantii
(96%),
сахаролитикам
Macellibacteroides fermentans
(98%)
и
Acetivibrio multivorans
(81%).
Кроме
того
,
консорциумы
содержали
последовательности
бактерий
,
родственных
некультивируемым
микроорганизмам
,
обнаруженным
ранее
в
низкотемпературных
природных
(
Арктика
,
Антарктика
)
и
антропогенных
(
психрофильные
анаэробные
биореакторы
,
низкотемпературное
нефтяное
хранилище
)
местах
обитания
(
табл
. 1, 2).
Полученные
результаты
позволяют
предположить
,
что
ряд
бактерий
в
исследованных
нами
консорциумах
принадлежит
к
новым
таксонам
.
4.2.
Исследование
архейной
составляющей
консорциумов
Методом
ДГГЭ
с
универсальными
архейными
праймерами
нами
была
проанализирована
архейная
составляющая
пропионат
-
и
бутират
-
окисляющих
консорциумов
.
В
обоих
консорциумах
были
выявлены
последовательности
гена
16S
рРНК
Methanosaeta
(99-100%
сходства
с
M
.
concilii
),
Methanospirillum
(97.5%
сходства
с
M. hungatei
)
и
Methanomethylovorans
(98-99%
сходства
с
M. hollandica
).
Полученные
результаты
позволили
нам
предположить
,
что
археон
со
сходством
последовательности
гена
16S
рРНК
97.5%
с
геном
16S
рРНК
M. hungatei
может
являться
новым
видом
Methanospirillum
.
Рис
. 4.
ДГГЭ
пропионат
-
окисляющего
(
а
)
и
бутират
-
окисляющего
(
б
)
консорциумов
.
Бактериальный
контроль
(
БК
).
Пропионат
-
окисляющий
консорциум
,
выращенный
при
10°
С
(
П
10)
и
30°
С
(
П
30).
Бутират
-
окисляющий
консорциум
,
выращенный
при
10°
С
(
Б
10)
и
30°
С
(
Б
30).
Таблица
1.
Филогенетическое
разнообразие
представителей
домена
Bacteria
пропионат
-
окисляющего
синтрофного
консорциума
Таксоны
в
генбанке
Консорциум
,
температура
инкубации
Номер
сиквенса
в
генбанке
Ближайшие
таксоны
%
сходства
генов
16S
рРНК
Источник
выделения
AB447697
Тип
Proteobacteri
a,
семейство
Syntrophaceae
,
Smithella propionica
97
Анаэробный
биореактор
CP002541
Тип
Spirochaetes
,
семейство
Spirochaetaceae,
Sphaerochaeta globosa
str. Buddy,
полный
геном
90
Пресноводный
осадок
EF034778
Домен
Bacteria
,
клон
92
Лед
Антарктического
озера
HE654006
Тип
Firmicutes
;
семейство
Syntrophomonadaceae
;
Syntrophomonas bryantii
96
Анаэробный
биореактор
Пропионат
10°
С
HQ020488
Тип
Bacteroidetes
;
семейство
Porphyromonadaceae
;
Macellibacteroides fermentans
98
Психрофильный
анаэробный
биореактор
EU517557
Тип
Firmicutes
;
семейство
Clostridiaceae
,
клон
96
Метаногенное
сообщество
нефтяного
пласта
HQ183984
Тип
Synergistetes
;
семейство
Synergistaceae
;
Aminobacterium
sp.,
клон
94
Свалочный
ил
GQ385405
Домен
Bacteria
,
клон
98
Завод
по
опреснению
воды
NR_042987
Тип
Bacteroidetes
;
семейство
Porphyromonadaceae
;
Petrimonas sulfuriphila
штамм
BN3
99
Низкотемпературное
нефтяное
хранилище
HE654006
Тип
Firmicutes
;
семейство
Syntrophomonadaceae
;
Syntrophomonas bryantii
96
Анаэробный
биореактор
Пропионат
30°
С
HQ020488
Тип
Bacteroidetes
;
семейство
Porphyromonadaceae
;
Macellibacteroides fermentans
98
Психрофильный
анаэробный
биореактор
1
Таблица
2.
Филогенетическое
разнообразие
представителей
домена
Bacteria
бутират
-
окисляющего
синтрофного
консорциума
Таксоны
в
генбанке
Консор
-
циум
,
температура
инкубации
Номер
сиквенса
в
генбанке
Ближайшие
таксоны
%
сходства
генов
16S
рРНК
Источник
выделения
HE654006
Тип
Firmicutes;
семейство
Syntrophomonadaceae
;
Syntrophomonas bryantii
96
Анаэробный
биореактор
HQ020488
Тип
Bacteroidetes
;
семейство
Porphyromonadaceae
;
Macellibacteroides
fermentans
98
Психрофильный
анаэробный
биореактор
EF034778
Домен
Bacteria
,
клон
99
Почва
полярной
Арктики
Бутират
10°
С
FJ645707
Тип
Firmicutes
;
Proteocatella sphenisci
штамм
PPP2
Т
(
психротолерантная
)
97
Помет
пингвина
HE659254
Домен
Bacteria
,
клон
95
Ливневые
сточные
воды
AB447697
Домен
Bacteria
,
клон
96
Низкотемпературный
анаэробный
биореактор
HE654006
Тип
Firmicutes
;
семейство
Syntrophomonadaceae
;
Syntrophomonas bryantii
96
Анаэробный
биореактор
JF262039
Тип
Firmicutes
;
семейство
Clostridiaceae
;
Youngiibacter fragile
штамм
232
81
Анаэробный
биореактор
FR749900
Тип
Firmicutes
;
Семейство
Ruminococcaceae
;
Acetivibrio multivorans
81
Анаэробный
биореактор
Бутират
30°
С
HQ020488
Тип
Bacteroidetes
;
семейство
Porphyromonadaceae
;
Macellibacteroides
fermentans
98
Психрофильный
анаэробный
биореактор
0
1
2
3
4
5
6
4
5
6
7
8
9
10 11 12
М
аксим
ал
ьн
ая
ско
ро
ст
ь
м
ет
ан
ообр
аз
ов
ан
ия
(
мм
ол
ь
/
л
в
су
тк
и
)
рН
0
2
4
6
8
10
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45
М
акс
им
ал
ьн
ая
ско
ро
ст
ь
м
ет
ан
ообр
аз
ов
ан
ия
(
мм
ол
ь
/
л
в
су
тк
и
)
Температура
(
o
C)
5.
Выделение
и
описание
нового
гидрогенотрофного
метаногена
Methanospirillum
stamsii
sp. nov.
штамм
Pt1
T
Из
пропионат
-
окисляющего
консорциума
методом
серийных
разведений
,
использованием
антибиотиков
и
получением
отдельных
колоний
на
твердой
агаризованной
среде
была
выделена
и
описана
чистая
культура
первого
психроактивного
гидрогенотрофного
метаногена
из
рода
Methanospirillum
–
Methanospirillum stamsii
Pt1
T
.
Основные
диагностические
признаки
приведены
ниже
.
Клетки
штамма
имеют
форму
изогнутых
палочек
,
размером
0.4–0.5
х
7.5–25
мкм
.
Клетки
образуют
нити
,
которые
иногда
достигают
в
длину
от
25
до
нескольких
сотен
мкм
(
рис
. 5
а
).
Клетки
штамма
подвижны
за
счет
пучка
полярно
расположенных
жгутиков
(
рис
. 5
б
).
При
высеве
на
агар
штамм
образует
колонии
светло
-
желтого
цвета
.
Штамм
Pt1
T
является
строгим
анаэробом
.
а
б
Штамм
Pt1
T
растет
в
диапазоне
температур
от
5
до
37°
С
с
оптимумом
роста
и
метанообразования
при
20–30°
С
(
рис
. 6
а
).
Диапазон
рН
для
роста
составляет
6.0–10.0
с
оптимумом
7.0–7.5 (
рис
. 6
б
).
Рост
штамма
Pt1
T
детектируется
в
интервале
от
0
до
0.3
М
NaCl.
Оптимальный
рост
наблюдается
в
отсутствие
NaCl
в
среде
.
а
б
Рис
. 6.
Максимальные
скорости
образования
метана
штаммом
Pt1
Т
при
разных
температурах
инкубации
(
а
)
и
в
средах
при
разном
значении
рН
при
температуре
25°
С
(
б
).
Штамм
Pt1
Т
использует
для
роста
смесь
H
2
/
С
O
2
(4:1).
На
ацетате
,
пирувате
,
метаноле
,
Рис
. 5.
Микрофотография
клеток
Methanospirillum stamsii
Pt1
T
.
Шкала
10
мкм
(
а
).
Электронная
фотография
жгутиков
клеток
Methanospirillum stamsii
Pt1
T
.
Шкала
0.4
мкм
(
б
).
13