Файл: Методичка микробиология.doc

Сабақтың сонында КБР төжірибесінің есепке алу, әр пробирканың алган

қорытындыларын талқылау — неге эритроциттердің лизисі болды? Неге болмады?

Иммуноэлектрофорез әдісі

Иммуноэлектрофорез әдісі өте сезімтал және спецификалылыгы жоғары, бұл өдіспен төмен концентрацияда және көп компоненттік жүйелерде антиген заттарды белгілеуге болады.

Иммуноэлектрофорез екі әдістің қосылуында негізделген — электрофорез және гельдегі преципитация. Әдістің қойылуы 2 сатыдан түрады.

Зерттеуге арналған затты (антигенді) олардың электрофоретикалық жылдамдық белсендігі бойынша электрофорез көмегімен гельде оның компоненттеріне бөледі. Бұл үшін ерітілген гельді шынылы пластинаға құяды, ол қатып қалған соң оның ортасында шұңқыр жасайды. Зерттеуге арналган затты шұнқырға енгізіп, пластинканы электрофорез аппаратына қояды. Зерттеу заттың компоненттері әр түрлі зоналарда тасымалдайды, оларды белгілі бояулармен анықтайды.

Электрофорезден кейін гельге иммундық сарысуын құйып преципитация реакциясын жүргізеді. Бұл үшін компоненттердің миграция жолдары бойынша гельде шұңқыр жасап, иммундық сарысуын шұңқырларға енгізеді. Антиденелер және электрофорезбен бөлінген антигендік компоненттері бір біріне қарсы гельде диффузияланады, кездеседі және ертінділі емес преципитат пайдалынады. Преципитаттар әр түрлі сызықтар болып, әр жерде орналасады. Осымен бірге әрі антиген гомологиялық антиденемен жеке байланысады да жеке сызық тудырады.

Сонымен, электрофорез өдісі зерттеу материалдың антигендік компоненттерінің санын белгілейді, электрофоретикалык козғалғышы бойынша идентификацияланады және спецификалы сарысумен преципитация сызықтарының мінездемесі бойьшша.

Иммунды ферментті анализ, ИФА

Зертгелетін материалдың құрамындағы микробтың антигенін немесе сарысуындағы антиденелерді анықтауға мүмкіндік беретін - бұл қатты фазалық иммунды ферментті анализ (қатты фазалық иммунды сорбентті анализ).

Тапсырма 3.

Микробтардың антигендерін ИФА бойынша анықтау

Ингредиенттері: полистиролды планшеттердің ойықтарына бекітілген белгілі антиденелер; құрамында микробтың антигені бар зерттелетін материал; зерттелетін микробтың антигеніне пероксидазамен (П_х) белгіленген специфихалық антиденелер; ортофенилендиамин (О_ф, бұл түссіз сұйық хромоген, бірақ пероксидазамен байланысса қоныр түсі пайда болады).

Полистиролды пробиркалардың қабырғасына белгілі антигенге қарсы антиденелерді (антидене қарсы антитенді) жабыстырады, зерттеуге арналған затты енгізеді, 30-40 мин 37°С инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады.

Техникасы, кезендері: 1. Белгілі антиденелер бекітілген полистиролды планшеттін ойықтарына микробтың антигені бар зерттелетін материал енгізіледі. 30-40 мин. 37°С инкубацияланады. Детергент қосылган арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады.

2. Пероксидазамен белгіленген антиденелер ойықтарға енгізіледі. 30-40 мин 37°С инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады.

3. Ортофенилендиамин қосылғаннан кейін планшеттер бөлменің қаранғы орында 20 мин. ұсталады. Қатты фазалы ИФА нәтижесі спектрофотометр Мультискан арқылы есептеледі.

Нәтижелері: зерттелетін материалдың құрамында микробтың антигендері болғанда олар ойықтардың түбіндегі антиденелермен байланысады. Пх белгіленген антигендерімен байланысады. At + Ag - Пх комплексі түзіледі. Ақырғы кезенде ойықтарға енгізілген Оф Пх-мен байланысып қоңыр түсті болады. Бұл нәтижелі реакция.

Егер зерттелетін материалда микробтың антигендері болмаса, онда буфермен шайғаннан кейін ойықтардың түбінде тек ғана белгілі антиденелер орналасады. Содан кейін енгізген Пх-мен белгіленген антиденелерде ойықтардан буфермен шайылып кетеді. Реакцияның аяғында Оф түссіз боп қалады. Бүл нәтижесіз реакция.

б) Спецификалық антиденелерді анықтау

Ингредиенттер: полистиролды планшеттердің ойықтарына бекітілген белгілі микробты антигендер; зерттелетін сарысу; пероксидазамен бекітілген белгілі микробты глобулинге қарсы сарысу; ортофенилендиамин.

ИФА қою техникасы, кезендері: 1. Белгілі микробтың антигендері бекітілген полистиролды планшеттің ойықтарына зерттелетін сарысу еңгізіледі. 30-40 мин. 37°С инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады.

Пероксидазамен белгіленген АГС ойықтарға енгізіледі. 37°С 30-40 мин. инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімеи ойықтар шайылады.

3. Ортофенилендиамин қосылғаннан кейін планшеттер бөлменің қараңғы орында 20 мин. ұсталады.

4. Қатты фазалы ИФА нөтижесі спектрофотометр Мультискан арқылы есептеледі

Нөтижелері: зерттелетін сарысудын құрамында антиденелер болғанда ойықтардың түбіндегі антигендермен байланысады және буферлы ертіндімен шайылып кетпейді. Содан кейін енгізілген АГС - Пх ойықтардың түбінде қалады. Ag + At + АГС - Пх комплексі түзіледі. Енгізілген Оф Пх-мен байланысып қоңыр түсті болады. Бұл нәтижелі реакция.

Егер зерттелетін сарысудың құрамында антиденелер болмаса, онда ойықтардың түбінде тек ғана алдын ала бекітілген микробтың антигені қалады. Содан кейін енгізілген АГС - Пх буферлы ертіндімен шайылып кетеді, ал Оф түссіз боп қалады. Бүл нәтижесіз реакция.

Радиоиммунды анализ, РИА

Зерттелетін материалдың құрамындағы антигенді, сондай-ақ сарысудың құрамындағы антиденелерді анықтауға бағытталған зерттеу әдісі.

РИА өткізу үшін антиген немесе антидене радиоизотоппен танбаланады және полистиролды планшеттін ойықтарының түбіне бекітіледі.

Микробтың антигенін анықтау үшін ойықтардың түбіне изотоппен таңбаланған антиделер бекітіледі. Содан соң бекілген антиденелерге құрамында микробтың антигені бар зерттелетін материал қосылады. Антиген-антидене комплексі түзілгеннен кейін ойықтарға изотоппен таңбаланған микробтың антигені қосылады. Таңбаланған микробты антиген тек ғана алдында енгізілген антигенмен байланысқаннан кейін қалған антиденелердің активті орталықтарымен қосылады. Ойықтардың түбінде қалған антигеннің пайзын немесе изотоптың мөлшерін есептеу арқылы әдістің нөтижесі бағаланады.

Тақырыбы: Жұқпалы аурулардың иммунопрофилактикасы және иммунотерапиясы. Иммунопатология (Иммунодефицитті жағдай, жоғары сезімталдық реакциясы, аутоиммундық процестер).

Сабақтың оқулық мақсаты

Студент білу керек:

1. Қазіргі заманның иммунопрофилактика және иммунотерапиясында қолданатын вакциналық препараттар, иммундық сарысулар, иммуноглобулиндер, олардың шығарып алу принциптерін.

2. Инфекцияға қарсы спецификалық және бейспецификалық қорғаныстың жалпы механизмдерін.

3. Вакциналар классификациясын.

4. Вакцинациядан кейін қалыптасқан иммунитеттің эффективтілігін бағалауын.

5. Тері-аллергиялық сынамалар, оның диагностикалық маңызы, микробтық антигендерін.

Студент атқара білу керек:

1. Жұқпалы аурулар диагностикасында, профилактикасында және емдеуінде антиинфекциялық иммунитеттің механизмнің білімдерін қолдану.

2. Жұқпалы аурулар диагностикасында тері-аллергиялық сынамалар қорытындысын бағалау.

Сабақ жоспары:

1. Инфекцияға қарсы спецификалық және бейспецификалық қорғаныс механизмдері схеманы талқылау.

2. Иммунды сарысулар және иммуноглобулиндер:

а) әр түрлі типті диагностикалық сарысуларын зерттеу, препараттармен танысу.

б) әр түрлі типті емдеу-профилактикалық сарысуларын және иммуноглобулиндерін зерттеу, препараттармен танысу.

3. Вакциналар: Вакциналық препараттардың талқылауы және зерттеуі, дайын вакцинаның тексеруін өткізу.

4. Иммунды реактивтілікті көтеруге арналған арнайы препараттар:

А) Адьюванттар (БЦЖ, пептидогликан, нуклеинат натрийі, жасанды

полиэлектролиттер және т.б.).

Б) Иммунитеттің В- және Т-жүйесінің модуляторлары, фагоцитоздың модуляторлары (миелопид, В - активин, спленин, Т - активин, пирогенал, продигиозан және т.б.) препараттарымен танысу.

5. Ваютинациядан кейін қалыптасқан иммунитеттің тиімділігін тексеру әдістері, ТЕГР есепке алу (күл және сіреспе токсиндеріне алтиденелерді табу үшін, қызылша вирусына антиденелерді анықтау үшін); гемагглютинацияны тежеу реакциясы (ГАТР) — грипп ауруында.

6. Инфекциялық аурулар терапиясы мен сақтандыруы үшін қолданатын гомо - және гетерологиялық иммуноглобулиндерді еңгізу әдістері.

7. Жоғары сезімталдықтың баяу типін анықтап, бағалау. Инфекциялық аурулар диагностикасында қолданатын аллергендерді демонстрациясы (бруцеллин, туберкулин, тулярин, Үі-тифин және т.б.).

Тақырып бойынша өз бетімен дайындалуға арналған сұрақтар:

1. Инфекцияға қарсы қорғаныс механизмдерін атап шығыңыз.

2. Инфекцияға қарсы қорғанышындағы иммунитеттің және резистенттілік механизмдері қалай байланысады.

3. Бактериялық инфекцияларда иммундық жауаптың ерекшеліктері қандай.

4. Вирустық инфекцияларда иммундық қорғаныстың ерекшеліктерін атап шығарыңыз.

5. Иммунитеттің қалыптасу түрлері. Антибактериялық иммунитет. Антитоксикалық иммунитет.

6. Активті иммунизация принципі неге негізделген.

7. Пассивті иммунизация кезінде кездесетін проблемалар.

8. Бірінші және екінші реттік антимикробтық иммундық жауапта негізгі топтағы антиденелердің түзілу кинетикасы.

9. Иммунологиялық есте сақтау түсінігі, клеткалық негізі және инфекцияга қарсы организмнің қорғанысындағы маңызы.

10. Антимикробтық және антитоксикалық иммунитетті қалыптастыру.

11. Вирустарға қарсы химиопрепараттар. Вирустың макроорганизмнің нысана торшасымен өзара әсер етуін тежейтін вирустық препараттарды дайындау.

12. Интерферондар. Интерферогендер.

13. Аллергия туралы түсініктер. Жоғары сезімталдықтың баяу типі.

14. Тері-аллергиялық сынамалар, диагностикалық маңызы, қолданылатын аллергендер.

Ақпаратты-дидактикалық блок

Бөтендігі бар антигендерді, соның ішінде жұқпалы аурулардың қоздырғыштарын тану және оларды жою — бұл иммундық жүйенің негізгі қызметі. Инфекцияға қарсы қорғаныс спецификалық және бейспецификалық механизмдерден өтуі мүмкіндігі бар болады.

Бейспецификалық және слецификалық қорғаныс механизмдерінің байланысуы суретте схемада көрсетілген

Активті иммунизация спецификалық иммунды жауатпың индукциясында және иммунологиялық есте тұрады. Иммунологиялық ес қоздырғыштың антигенімен екінші рет кездескенде екінші иммундық жауап қысқа латентті мезгілімен береді.

Көбінесе бактериялық инфекциялардың қоздырғыштары клетканың
сыртында көбееді. Спецификалық антиденелер бактериялардың үстімен
байланысып комплемент қатысуымен цитотоксикалық реакцияларды туғызады (бактериолизис). Және де антиденелермен және комплементтермен тиелген бактериялар өте жеңіл фагоцитоздайды (опсонизация). Бірақта, фагоциттармен ұсталган кейбір бактериялар өлмейді (стрептококктар, сальмонеллалардың кейбір штаммдары, туберкулез
микобактериялары, алапес микобактериялары, менингококктар, гонококктар).

Кейбір инфекциялардың патогенезінде экзотоксиндердің негізгі мағынасы бар болады (мысалы, сіреспе, газды гангрена, дифтерия). Егер қанда токсин - спецификалық антиденелер (антитоксиндер) болса олар токсиндерді бейтараптандырады (нейтрализация), яғни олардың пайда болуы көбінесе өте кеш болады, сондықтан адам организмін қорғау күйі болмайды. Сонымен, мысалы, сіреспе инфекциясын болжамдағанда дереу антитоксикалык антиденелерді енгізеді (пассивті иммунизация).

Профилактикалық иммунизация потенциальдық иммунизация жасайды, қайсысының арқасында организм инфекцияға екінші қайтара иммундык жауаппен қарсы алады. Бұл жауап дер кезінде токсиннің бейтараптануын (нейтрализация) қамсыздандырады.

Жасушалық иммунитеттің кейбір жағдайда ерекше мағынасы зор, фагоцитоздың қорғаныс маңызы бола тұрса да, in vivo патогенді бактериялар (мысалы, микобактериялар, бруцеллалар және т.б.) өмірге бейімділігін сақтайды және көбееді; созылмалы қабыну процессі пайда болады (лимфатикалық клеткалардың және макрофагтардың жиылуы). Жасушалық иммунитеттің бар болуын тері ішіне сынау жасап анықтауға болады. Кенет оң тері сынауы міндетті түрде бермейді белгілі инфекция жөнінде.

Студенттің өзіндік жұмысы

Тапсырма 1. Дайын вакцинаның тексеруін өткізу:

Вакцинаның мінездемесін мазмұндау - тірі, өлтірілген немесе химиялық;

Вакцинаның сыртқы түрі - қүрғақ, сұйық, мөлдір немесе мөлдірсіз

Вакцинаның стерилдендігін тексеру - ЕПА, ЕПС, Китта-Тароцци қоректік орталарына егу. Вакцинаның зиянсыздығын тексеру экспериментальды тышқандардың тері астына 0.5 мл вакцинаны енгізу.

Микроскопия - Грам бойынша жүғынды бояп морфологиясын анықтау.

Вакцинаның тұңбасын оптикалық стандартының тұңбасымен салыстыру (1 млрд = түңбаның 10 ЕД)

Қорытындыны альбомға жазу

Тапсырма 2. Вакцинациядан кейін қалыптасқан иммунитет дәрежесін анықтау.

Бағалау әдістері:

• вакцина енгізілгендердің сарысуымен серологиялық реакция қою

• тері-аллергиялық сынама жүргізу

Дифтерия мен сіреспеге қарсы вакцина егілгендердің сарысуымен ТЕГР қорытындысы нәтижесін бағалау. Қорытындысын альбомга жазу.

Тапсырма 3. Вакциналық препараттардың демонстрациясын көру, альбомға мысалдарын жазу.

а) тірі вакцинамен келесі инфекцияларға қарсы арнайы сақтандыруы
жүргізіледі:

туберкулезден (БЦЖ);

полиомиелиттен (Сэбин вакцинасы 1,2, 3 серотиптері);

обадан (Е, В);

сібір түйнемеден (СТИ);

Ку-безгектен (М-44);

Грипп, қызылша (Л-16).

б) өлтірілген вакцинамен келесі инфекцияларға қарсы арнайы
сақтандыруы жүргізіледі:

- көкжөтел (АКДС),

- лептоспироз

- грипп

- кенелі энцефалит

в) химиялық вакциналар (протективтік антигендердің экстракциясы):

- менингококктық инфекция

- іш сүзегі

- грипп (грипп вирусының гемагглютинин мен нейраминидазадан)

г) анатоксиндер:

- стафилококктық

- адсорбцияланган сіреспелік анатоксин

- перфрингенс А адсорбцияланган анатоксині

- ботулинистикалық А, В, Е варианттарына

- дифтерияға қарсы анатоксин

Ассоциацияланган және комбинирленген вакциналар: АКДС-вакцина

Протоколды схема бойынша толтыру

Тапсырма 3. Демонстрациялық бактериологиялық препараттарды қолдану бағытын анықтау

Тапсырма 4. Демонстрациядағы иммуноглобулиндер препараттарын көру. Мысалдарын альбомға жазу.

Сарысулық препараттар: емдеу-профилактикалық, диагностикалық, моноклональды антиденелер.

Интерферондар - жануардан алынган белок, жасушалармен вирустық инфекцияга қарсы бөлінеді. Вирустардың репродукциясын тежейді, сондықтан вирустарға қарсы препарат болып қолданылады. Интерферондардың үш тобы анықталған: