Файл: Методичка микробиология.doc

Ақпаратты—дидактикалык блок.

Антигендер — генетикалық бөгде заттар, адам организміне енгізгенде иммундық жауап тудырады (гуморальдық жөне жасушалық). Антигеннің беткейінде антигендік детерминанттар (детерминантты топтар) орналасады. Олар антигеннің спецификалығына жауапты.

Гуморальдық иммундық жауап антигендерге қарсы спецификалық алтиденелермен пайда болуымен көрінеді. Бүны организмнің иммундық жүйесі уш типті жасушалардың - макрофагтар, Т- жөне В-лимфоциттер қатысуымен жасайды.

Антиденелер - иммуноглобулин дер, спецификалық активтік орталарымен белгілі антигенмен комплекс антиген+антидене пайда болғызып байланысады. Антидененің активті ортасы ауыр және жеңіл полипептидтік тізбектерден пайда болған. Иммуноглобулиннің активтік ортасының пішіні, көлемі гомологиялық антигеннің детерминантына сөйкес келеді, ягни антиген+антидене комплексте байланысып иммунитет реакцияларын қалыптастырады. Иммунитет реакциялары ажыратылады антиген мінездемесі және өту жағдайы бойынша. Реакция екі фазадан құралады: спецификалық (көрінбейді) және (спецификалык емес).

Агглютинация реакциясы

Агглютинация реакциясы - микробтардың немесе басқа да жасушалардың электролит көмегімен жабысуы, яғни спецификалык антиденелер (агглютининдер) корпускулярлық антигендермен (агглютиногендер) өзара байланысы көзге көрінетін конгломерат ретінде көрінуі. Агглютинация реакциялары жұқпалы аурулар диагностикасында кең қолдануда:

Бөліп алған микробқа идентификациясын жүргізу - антигендік құрылысын анықтау (серотипирлеу), бұл үшін белгілі антиденелерімен агглютинирлеу диагностикалық (анықтаулық) сары су қажет. Реакцияның қорытындысы оң болса - зерттелген микроб сол микробқа сәйкес, қайсысымен бұл анықтаулық сары суын шығарып алу үшін жануарларды иммунизирлейді (сол микробпен жануарларды жұқтырып, жануардың организмінде - қанында антиденелер пайда болады).

Ауру адамның қанның сары суында осы аурудың тудырған микробқа қарсы антиденелерді танып алу үшін (серодиагностика) антиген түрінде белгілі микробтың дақылын (диагностикум) алады. Реакцияның қорытындысы оң болса - осы түрдің микробтары аурудың қоздырғышы болып келеді, себебі аурудың дамуында ауру адамның сары суында микробқа-антигенге қарсы спецификалық қорғаныс антиденелер пайда болған.

Студенттің өзіндік жұмысы

Талсырма 1 Агглютинация реакциясын қою (ингредиенттерді тексеру)

Пробиркаларды термостатта 2 сағатқа 37°С сактайды, қорытындысын сабақтың аяғында тексереді.

Тапсырма 2. Бөліп алған микробқа идентификациясын жасау үшін шыныда агглютинация реакциясын кою тәжірибиесі.

Ескерту: Иммундық сары су тамшысы бар бактериялық ілмекті физ.ертіндісіне қосуға болмайды. Микробтардың жабысуы тәжірибенің бірінші минутынан бастап көрінеді, шыныны сәл айналдырғанда қоспада түйіршіктер пайда бола бастайды, үлкейіп тамшының шетіне шығады. Бақылау қоспасында біркелкі гомогенді лайлану байқалады. Тәжірибенің қорытындысының суретін альбомға салу керек.

Тікелей емес (пассивті) гемагглютинадия реакциясы (ТЕГР)

Бұл реакция — агглютинация реакциясының бір түрі, негізгі принципі -эритроциттер өз беткейіне ертінді антигендер және гаптендерді жабыстыра (адсорбция) алатын қабілеті (бактерияларды, вирустарды және т.б. микроорганизмдерді). Осы жағдайда эритроциттер жаңа серологиялық арнайы қабілетке ие болады, сондықтан иммундық сары сулармен, гомологиялық адсорбцияланған антигендермен агглютинация реакциясына қатысады. Осындай эритроциттерді сенсибилизацияланған эритроциттер, эритроцитарлық диагаостикум деп атайды. Сенсибилизацияланған эритроциттерді алу үшін эритроциттерді алдын-ала танинмен 1:20000 ертіндіде өңдейді, бұл жағдайда олардың адсорбцияланатын қабілеті (жабысу) жоғарлайды. Реакцияны полистеролдық плашнетаға немесе пробиркада жасайды. Тексерілетін қан сары суындағы комплементтен ажырату үшін алдын ала 58°С 30 мин қыздырады. Сосын сары судан ертінді қатарын дайындайды 1:10-нан 1:12000-ге дейін және одан жоғары, 0.5 мл пробиркаларға немесе планшета лункаларына құяды. Әр сары су ертіндісіне 0.1 мл эритроцитарлық диагностикум қосады. Реакцияны бөлме температурасында 2 сағат ұстайды немесе термостатта. Қорытындысы оң + - егер пробирка немесе лунка түбіндегі эритроциттер тұнбасының шеттері иректелген - қол шатыр теріздес. Реакцияның қорытындысы теріс - жағдайда эритроциттер тұнбасы біркелкі түбіне түседі, түйме тәріздес.

Тапсырма 3. ТЕГР (РПГА) қою төжірибесі (ауру адамның микробқа қарсы антидснелерін табу үшін). Серодиагностика.

ТЕГР-ны қою схемасы (Видаль реакциясы - іш сүзектің диагностикасы)

Ескерту: бірінші пробиркадан 1,0 мл екіншіге апару, 2-ші пробиркадан 3-ге, 3-ші пробиркадан - 4-ге, 5-ден 1,0 мл дез.ертіндісіне құйып тастау. Диагностикумның 0,1 мл-ден әрбір пробиркаға енгізу, 2 сағатқа термостатқа қою немесе бөлмеде сақтау. Қорытындысын 2 сағаттан кейін жүргізеді.

ТЕГР-ны есептеу, альбомға сурет салу, зерттеген сары судың титрін анықтау.

Коагглютинация реакциясы.

Бұл реакция - агглютинация реакциясының бір түрі: стафилококктың А—белогы иммуноглобулиндердің IgG тобы молекуланың Ғс-фрагментімен спецификалық емес байланысуға қабілетті. Коагглютинация реакциясын қою үшін стафилококктың Cowan—1 штаммын қолданылады (осыдан әдістің атауы - Co—(Ко-)-агглютинация.

Коагглютинация реакциясьгн екі вариантта қолданылады:

1. Әр түрлі биологиялық сұйықтықтарда патогенді микроорганизмдердің антигендерін табу үшін (несепте т.б.) Бүл үшін антиденелік Ко—диагностикум дайындайды: - стафилококк жасушаларының үстінде белгілі спецификалық IgG-ді адсорбциялайды (жабыстырады). Зерттейтін құралда антиген (Аг) бар болса еңгізген Ко— диагностикумымен тез арада агглютинация болады.

б) антигені бар зерттеу құралға қосу.

Осындай вариант көкжөтел, менингококтық инфекциялардың және т. б. тез арада анықтауын қою үшін қолданылады.

2. Созылмалы бактериялық инфекцияларды анықтау үшін.

Созылмалы инфекциялардың қоздырғыштары өз беткейінде спецификалық антиденелерді тасымалдайды, сондықтан олар стафилококк Cowan-1 штаммымен агглютинация реакциясын беруі мүмкіндігі бар. Мысалы, пиелонефрит ауруында әр түрлі шартты-патогенді бактериялар бөлінеді (E.coli, P.aeruginosa, эпидермальды стафилоккк және т.б.).

Шығарып алынған дақыл Cowan-1 штаммымен агглютинация берсе, бұл созылмалы инфекция деп есептелінеді.

Кумбс реакциясы (антиглобулинді реакция)

Бұл реакцияны құрамында 1 ғана белсенді орталығы бар және антигеннің бір детерминантты тобымен байланысатын толық емес (моновалентті, тежеуші) антиденені анықтау үшін қолданады. Сондықтан да пайда болған антиген-антидене комплексі микроагрегат, тұнба түзбейді, лайланбайды және басқа да өзгерістерге ұшырамайды. Ал Кумбс реакциясы нәтижені көзбен қарап-ақ бағалауға мүмкіндік береді. Диагностика үшін: резус-келіспеушілікте, бруцеллезде, аутоиммунды ауруларда (қызыл бөрі ауруы, полиартрит) қолданады.

Мақсаты: Жүкті әйелдің зерттелетін сары су құрамында, резус-антигенге қарсы толық емес антиденені анықтау үшін. Ингредиенттері: зерттелетін сары су, қоянның антиглобулинді сарысуы (АГС), құрамында резус-антигені бар эритроцит. АГС-ті қоянды адамның глобулиндерімен иммунизациялау жолы арқылы дайындайды. АГС-тің құрамында адамның әртурлі глобулиндеріне қарсы толық, бивалентті антиденелер бар.

Техникасы және нәтижесі:

Зерттелетін сарысуға резус-антигені бар эритроцит қосылады. 1 сағат инкубациядан кейін АГС-ті енгізеді. Реакция нәтижелі болса, гемагглютинация байқалады.

Преципитация реакциясы

Преципитация реакциясы электролит қатысуында спецификалық
антиденелермен (преципитиндермен) ұсақ бытыраулы (мелкодисперсные)
антигендердің (преципитогендердің) тұндыру. Ертілмейтін антиген + анти-дене тұнба жөнінде комплекстің тұндырылуы тек қана ингредиенттердің баламалы ара қатысында байқалады. Преципитиноген мөлдір коллоидты ертінді болу керек. Преципитация реакциясы антиденелер ұстайтын белгілі преципитациялайтын сары су бойынша антигендерді анықтау үшін қолданылады; сары суды жануарларды белгілі антигенмен иммунизация жасап алады.

а) Кольцепреципитация реакциясын қою үшін пробиркаларға (диаметрі 0.5 см) 0,1 мл диагностикалық сары суын әр түрлі антигендерге қарсы құяды, сосын оның үстіне Пастер пипеткасымен пробирканың қабырғасымен зерттейтін құралды қабаттайды. Реакцияны 1-2 минуттан кейін есептейді. Реакцияның қорытындысы оң болса - сары судың және зерттейтін құралдың арасында ақ сақина сияқты преципитат пайда болады. Бақылау (контроль) пробиркада болмау керек.

б) Гельдегі преципитация реакциясы: антиген және антидене гельде байланысып, преципитат пайдалынады. Преципитат гельде ақ түсті сызық болып келеді.

Қою техникасыны бойынша преципитация реакциясының екі түрін ажыратады:

1. Қарапайым диффузия әдісі: иммундық сары су қосылған бір қабатты агарды гель дайындайды және осы қабатта істелінген шұңқырға антиген еңгізіледі.

2. Оухтерлони бойынша екі қабатты диффузия әдісі: антигендер және антиденелер агарды гельдің әр түрлі шұңқырларына еңгізеді, олар диффундирлеп кездеседі, преципитат сызықтары пайда болады. Осы реакцияны қою үшін шыныларды мөлдір агарымен қүйып еңгізеді, бұл агарда сосын аралары бірдей шұңқырлар жасайды.

Иммунофлюоресцентті әдіс

Бұл әдіс арқылы тез арада (1-2 сағат) микробтардың әр түрлі антигендерін анықтауға болады (бактериялар, риккетсиялар, вирустар және т.б.) немесе антиденелердің тіңдерде немесе мүшелерде орналасуын табуға болады. Бұл әдісті жүргізу үшін антиденелерді немесе антигендерді флюорохромды бояулармен белгілейді. Реакция болғаннан соң препараттарды люминесценттік микроскоппен зерттейді. Антигендер боялған антиденелермен байланысып препараттың қараңгы фонында жарқырап тұрады.

Микробиологиялық зерттеулерді жүргізу үшін тура және тура емес иммунофлюоресценция әдістері қолданылады.

Практикалық микробиологияда және вирусологияда иммунофлюоресценттік әдісі көбінесе жұқпалы ауруларды анықтау үшін экспресс -әдіс ретінде қолданылады. ЖРВИ-да ИФР қою схемасын талқылау (грипп, парагрипп, аденовирустық инфекцияларды дифференциясын жасау).

Тақырыбы: Лизис, бактериолиз, комплемент байланыстыру реакциялары. Нейтралдау реакциясы. Радиоиммундық, иммуноферменттік анализдер. Бактериялардың иммобилизация реакциясы. Полимеразды тізбекті реакция.

Сабақтың оқулық мақсаты:

Студент білу керек:

1. Әр түрлі тобындагы иммуноглобулиндерді, антидененің пайда болуы, иммунитеттегі антиденелердің маңызы.

2. Комплемент, иммунологиялық реакцияларьшда оның қатысуы және активтену жолдары.

Студент атқара білу керек:

1. Лизис реакциясын қою

2. Комплемент байланыстыру реакциясын қою

3. Нейтрализация реакциясын (флокуляция) қою

4. Радиоиммунды, иммуноферментті реакцияларын қою және есептеу

5. Қозгалғыш бактериялардың иммобилизация реакциясын қою

Такырып бойынша өз бетімен дайындалуға арналған сұрақтар:

1. Әр турлі топтағы иммуноглобулиндері, олардың мінездемесі. IgM, IgG, IgA, IgD, IgE, S-IgA иммуноглобулиндердің молекулалық құрылысы. Активтік орталарының спецификалығы.

2. Иммунитетте антиденелердің маңызы.

3. Антиденелердің пайда болуы. Иммуногенездің фазалары. Бірінші және екінші иммундық жауаптағы антиденелердің көбеюінің ағымы.

4. Бактериялық инфекцияларда организмнің қорғанышындағы секреторлық S-IgA маңызы.

5. Иммундық лизистік реакциясы, механизмі, қажетті ингредиенттер.

6. Комплемент, оның компоненттері. Иммунологиялық реакцияларда қатысуы. Классикалық және альтернативтік жолдарымен комплементтің активтенуі.

7. Комплементті байланыстыру реакциясы (КБР). Реакцияға қатысатын жүйелер, ингредиенттері, КБР механизмі. КБР практикада қолдануы.

8. Иммуноферменттік өдіс, принципі, қолдануы.

9. Радиоиммундык өдіс, принципі, қолдануы.

Ақпараттық-дидактикалық блок

Иммунды лизис реакцясы (бактериолиз, гемолиз).

Бұл реакцияның негізінде арнайы антиденелердің (бактериолизин, гемолизиндер) корпускулярлы антигендермен (бактериялар, эритроциттер) иммунды жинақ (комплекс) түзу қасиеті жатыр. Эритроциттердің (гемолиз) немесе бактериялардың (бактериолиз) лизисімен (еруімен) және классикалық типте комплементтің белсендірілуімен қатар жүреді. Комплемент ретінде теңіз шошқасының жаңа сарысуы немесе қүрғақ "••" лиофилизация әдісімен дайындалған препарат қолданылады. Бактериолиз реакциясын қою үшін, бактериолизині бар зерттелетін сарысуға комплемент және белгілі микроорганизмдердің төуліктік дақылын қосады. Тығыз қоректік ортаға себу 2 сағат инкубациядан кейін жүргізіледі. Бактериялардың лизисі комплемент пен лизиндердің қатысуымен болады. Бұл кезде бақылау егісіне қарағанда өскен колониялардың санының тез азаюы байқалады. Бақылау егісі (төуліктік дақыл+комллемент; төуліктік дақыл+зерттелетін сарысу).

Студенттің өзіндік жұмысы

1. Лизис реакциясы пробиркада (in vitro)

2. Гемолиз реакциясына катысады: 1. Антиген - шайылган қой эритроциттері (нативті немесе консервлеген) - 0.3 мл қой эритроциттері + 9.7 мл натрий хлоридінің изотонияльгқ ертіндісі.

3. Антидене - гемолитикалық сарысу (гемолизин) қой эритроциттеріне қарсы, ертіндісі үш есе томен. Мысалы, сарысу титрі 1:1200 болганда сарысуды 400 есе ерітеді (0.1 мл сарысуға + 39.9 мл натрий хлоридішң изотонияльгқ ертіндісі).

4. Комплементті ерітеді 1:10 (0.2 мл комплемент* 1.8 мл натрий хлоридініц изотониялық ертіндісі).