Файл: Курсовая работа на тему Модель многосубстратного процесса микробного роста Простейшие кинетические схемы обобщенная модель многосубстратного микробного процесса.doc
Добавлен: 23.11.2023
Просмотров: 80
Скачиваний: 4
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Stella, Prosthecochloris и Caulobacter, приспособлены к обитанию в средах с низким содержанием субстратов; при культивировании в лабораторных условиях образуемые их клетками стебельки растут в длину по мере уменьшения концентрации субстратов. Хотя эти клеточные выросты участвуют также в размножении клеток и бесспорно еще не доказано, что они «выстланы» транспортными белками, достигаемое таким путем увеличение поверхности клетки, очевидно, дает преимущество в условиях голодания. В то же время при данной стратегии возрастают потери энергии в результате утечки протонов через увеличенную поверхность клетки.
Одним из способов длительного выживания в условиях голодания путем снижения энергетических затрат служит образование спор. Такой переход в покоящуюся стадию обеспечивает независимость от питания, а также защиту от высыхания и нагревания, например у поверхности почвы. Другие предназначенные для выживания устойчивые формы, встречающиеся у отдельных групп микроорганизмов, - это цисты, миксоспоры и акинеты.
Многие грамотрицательные бактерии при неблагоприятных условиях не образуют спор, но вместо этого снижают свою потребность в энергии путем уменьшения размеров клеток. При такой стратегии уменьшается также трата энергии на поддержание мембранного потенциала. Образование подобных карликовых форм («карликовость») довольно широко распространено у бактерий в незагрязненных озерах и морской воде. Средние размеры бактериальных клеток в бедных питательными веществами местообитаниях во много (до 30) раз меньше, чем размеры не голодающих клеток, как показывает изучение морских бактерий при различных концентрациях субстрата.
У голодающих бактерий часто встречается образование слизи. Внеклеточная слизь помогает сохранению протонного градиента, поддержанию протондвижущей силы и мембранного потенциала. Однако более важна роль слизи в сохранении воды при высыхании и участие ее в прикреплении клеток к поверхностям, имеющем, по-видимому, большое значение для обеспечения субстратом при его низкой концентрации.
4. Снижение числа микробных клеток вследствие выедания консументами или лизиса под действием бактериофагов
Приросту численности микробных клеток противодействуют в природе выедание, фаговая инфекция и гибель в результате голодания. В водных местообитаниях бактериальные популяции выедаются простейшими, а также коловратками и некоторыми веслоногими рачками. Ресничные инфузории, жгутиконосцы и веслоногие питаются взвешенными бактериальными клетками, отцеживая их из свободной воды, тогда как амебы, коловратки и нематоды поедают преимущественно прикрепленные бактериальные клетки. Прикрепление к поверхностям - одна из стратегий, позволяющих избежать выедания животными, питающимися бактериями.
В то же время заметные агрегаты бактерий на разлагающемся детрите поедают более крупные животные, в том числе питающиеся планктоном рыбы, лишенные приспособлений для фильтрации воды.
Выедание снижает величину бактериальной популяции и на первый взгляд кажется повреждающим фактором. Однако уменьшение популяции приводит также к ослаблению конкуренции за субстраты и, таким образом, способствует повышению концентрации субстрата, его обороту и скорости роста бактерий, поддерживая микробную популяцию в активном состоянии. Таким образом, размеры бактериальной популяции зависят как от поступления питательных веществ, так и от выедания, и оба эти фактора влияют один на другой через бактериальную популяцию.
Питающиеся бактериями животные превращают микробную биомассу в животную биомассу с эффективностью, по данным лабораторных экспериментов, примерно 50%. Это означает, что половина биомассы-пищи минерализуется, обеспечивая энергию для ассимиляции другой ее половины животным-консументом.
Названные выше животные, питающиеся бактериями, относятся к аэробам, т.е. проявляют активность в аэробных местообитаниях; о значении питания бактериями в анаэробных средах мало что известно. С открытием факультативно или строго анаэробных ресничных простейших, жгутиконосцев и грибов, обитающих в бескислородных осадках, рубце жвачных животных и других подобных местообитаниях, возник вопрос о роли этих организмов в регуляции численности бактерий в анаэробных сообществах. Опыты по кормлению анаэробных ресничных инфузорий из бескислородных вод высокоэвтрофных озер показали, что эффективность их питания значительно ниже (составляет примерно 5%) по сравнению с аэробными ресничными инфузориями, вследствие низкого энергетического выхода. Таким образом, в анаэробных средах могут поддерживаться лишь незначительные популяции простейших, питающихся бактериями. Питание анаэробных животных и соответственно величина их популяций лимитированы также из-за прикрепления бактерий к поверхностям, особенно в осадках.
Вклад в регуляцию численности бактерий в природных популяциях вносят также бактериофаги. В последние годы становятся известными все новые их виды, и можно предполагать, что ни один из ныне известных видов бактерий не защищен полностью от поражения фагами.
Значение бактериофагов как факторов контроля бактериальных популяций в природе, возможно, проявляется лишь в некоторых ситуациях, например если генетически однородные популяции бактерий-хозяев достигают высокой плотности, как при цветении морских цианобактерий, когда гибель клеток на 50% обусловлена фаговой инфекцией. Популяции, например гетеротрофных бактерий в толще воды, слишком немногочисленны и слишком гетерогенны для того, чтобы численность фагов поддерживалась на достаточно высоком уровне, позволяющем им влиять на численность этих бактерий-хозяев. По предварительным оценкам, гибель клеток бактерий всего на 5 - 10% вызвана лизисом под действием фагов. О значении фагов в почвах или осадках данных пока не имеется, поскольку чрезвычайно сложно проводить микроскопическое исследование этих местообитаний.
5. Методы количественного анализа микробной популяции в природе
Для количественной оценки микробных сообществ в природе необходимы специальные методы, отличные от используемых при изучении лабораторных культур. Прямой подсчет клеток под микроскопом на первый взгляд может казаться весьма подходящим методом, но на самом деле он применим только для анализа проб воды. Однако даже в такой среде большинство бактерий прикреплено к частицам детрита и едва различимо при непосредственной микроскопии. Чтобы визуализировать бактериальные клетки в пробах воды, их окрашивают флуоресцентными красителями, такими как акридиновый оранжевый или 4', 6-диамидино-2-фенилиндол (ДАФИ). Эти красители проникают через плазматическую мембрану и связываются либо с клеточными белками (акридиновый оранжевый), либо с двухцепочечной ДНК (ДАФИ), обеспечивая специфическое окрашивание бактериальных клеток. Однако вопреки более ранним сведениям эти красители не позволяют различать живые и мертвые клетки и среди подсчитанных с их помощью клеток может быть значительная доля мертвых. Имеется возможность специфически выявлять активно дышащие бактерии, используя новые красители, которые образуют флуоресцентные производные только после восстановления дыхательными ферментами (например, 5-циано - 2,3 - дитолил-тетразолийхлорид). Прямой подсчет с применением флуоресцентных красителей не пригоден, однако, как метод для исследования образцов осадков или почв, поскольку в этих средах слишком велик фон естественно флуоресцирующих соединений.
Другие методы, позволяющие выявлять метаболически активные клетки, основаны на применении радиоактивных меток и радиоавтографии. Для определения синтеза белка и роста клеток используют 14С-лейцин, синтеза ДНК и размножения клеток - 3Н-тимидин. Оба эти маркера использовались в прошлом главным образом для изучения проб воды и осадков, но получаемые таким способом данные нельзя считать точными, поскольку внесенный меченый предшественник частично разлагается микробами и доступная в результате информация не соизмерима с усилиями, затраченными на эксперименты.
Оценка численности клеток в бактериальных популяциях чашечным методом Коха, т.е. путем высева на плотные среды в чашках Петри и культивирования, даже при использовании сложных и относительно неспецифических сред дает весьма разочаровывающие результаты. Общее число колоний, например на казеино-крахмало-пептонном агаре, применяемом в качестве
стандартной среды для учета пресноводных бактерий, обычно на 1-2 порядка ниже, чем количество клеток, определяемое путем прямого микроскопирования. Это означает, что лишь 1 - 10% клеток микробного сообщества могут давать колонии при использовании данной методики, и другие среды в этом отношении отнюдь не лучше.
Другой метод количественного учета клеток с помощью культивирования - это метод наиболее вероятного числа. Для определения числа микробов этим способом готовят последовательные разведения (1:10) исследуемого материала в пробирках с жидкой питательной средой не менее чем в трех повторностях и инкубируют пробирки в течение времени, необходимого для проявления роста (помутнения среды). Предполагая, что в последней пробирке, где после достаточного периода инкубации наблюдается рост, находилась исходно одна-единственная клетка, подсчитывают исходное число бактерий в образце. Преимущество данного метода состоит в том, что в жидкой среде в отсутствие контакта с воздухом могут расти даже довольно чувствительные к О2 бактерии, а также в том, что непосредственно в пробирках с разведениями можно определять, например, продукты метаболизма. Недостатком такого подсчета клеток является значительная статистическая неопределенность, связанная с оценкой результатов по принципу «да» или «нет» в трех независимых повторностях разведений.
Культивирование позволяет получить более достоверные сведения, если оно применяется для количественного определения конкретных метаболических групп бактерий. Так, метаногенные бактерии, растущие с использованием водорода/формиата, можно непосредственно подсчитывать в виде колоний в чашках Петри благодаря естественной флуоресценции, выявляя таким образом 20-50% клеток их популяции. Сульфатредуцирующие бактерии также довольно успешно подсчитываются путем культивирования с применением адекватных сред.
Все эти подсчеты - путем прямой микроскопии или с помощью культивирования - имеют в основе допущение, что микробные клетки распределены как отдельные единицы и в этом виде различимы оптически либо по признаку роста. Однако в природных местообитаниях микробы часто образуют более или менее крупные агрегаты или прикрепляются к поверхностям, в том числе к частицам растительного или животного детрита, осадков или почвы, поэтому для их количественного учета с использованием любого из вышеупомянутых методов необходимо предварительно отделить клетки от субстратов (поверхностей), не нарушая жизнеспособности. Возможные способы такого отделения - это встряхивание, гомогенизация или мягкая обработка проб ультразвуком в присутствии пирофосфата, хелатирующих агентов либо детергентов. Следует, однако, учитывать, что эти процедуры вызовут гибель некоторых бактерий и пригодны лишь в качестве компромиссного решения.
Совершенно иной подход к анализу природных популяций состоит в том, что в качестве показателей биомассы используются клеточные компоненты (химические маркеры). Общую живую биомассу (в действительности почти в любой экосистеме она представлена главным образом микробной биомассой) можно количественно оценить, например в почвенном образце, путем определения общего содержания АТР. Показателем биомассы может служить также общее количество ДНК при условии, что процедура экстракции позволяет отделить ДНК из живых клеток от ДНК мертвых клеток, прикрепленных к почвенным частицам. В почвенной микробиологии довольно широко применяется метод фумигации, который состоит в том, что образец подвергают обработке парами хлороформа, при которой большая часть микробов погибает. Затем в течение 10 суток измеряют количество СО2, образующегося в результате окисления отмершей биомассы выжившими клетками. Количество СО2 считают показателем исходного содержания количества биомассы. В качестве альтернативного показателя определяют общую дегидрогеназную активность клеток по восстановлению ими солей тетразолия или диметилсульфоксида.
Более специфичная в отношении отдельных таксонов информация может быть получена при анализе специфических клеточных компонентов. Так, специфичной таксономической характеристикой служит профиль клеточных жирных кислот. К сожалению, для определения метаболических групп прокариот этот параметр малоприменим, поскольку лишь немногие из них, подобно сульфатредукторам, характеризуются специфическим составом жирных кислот. Следует учитывать также, что жирнокислотный состав мембранных липидов подвержен изменениям в зависимости от условий среды. Кроме того, этот метод предусматривает сравнение с чистыми культурами исследуемых бактерий, но культивируемые микроорганизмы, как подчеркивалось выше, часто составляют лишь малую и нерепрезентативную фракцию общей популяции в данном образце.
Химическим показателем присутствия грибов в сложном микробном сообществе служит эргостерол.
Для выявления и идентификации определенных типов бактерий в природных образцах применяют флуоресцентные антитела. В зависимости от использованных для их получения антигенов антитела могут быть направлены против клеточных компонентов, специфичных для отдельного штамма, вида или рода, поэтому уровень специфичности
Одним из способов длительного выживания в условиях голодания путем снижения энергетических затрат служит образование спор. Такой переход в покоящуюся стадию обеспечивает независимость от питания, а также защиту от высыхания и нагревания, например у поверхности почвы. Другие предназначенные для выживания устойчивые формы, встречающиеся у отдельных групп микроорганизмов, - это цисты, миксоспоры и акинеты.
Многие грамотрицательные бактерии при неблагоприятных условиях не образуют спор, но вместо этого снижают свою потребность в энергии путем уменьшения размеров клеток. При такой стратегии уменьшается также трата энергии на поддержание мембранного потенциала. Образование подобных карликовых форм («карликовость») довольно широко распространено у бактерий в незагрязненных озерах и морской воде. Средние размеры бактериальных клеток в бедных питательными веществами местообитаниях во много (до 30) раз меньше, чем размеры не голодающих клеток, как показывает изучение морских бактерий при различных концентрациях субстрата.
У голодающих бактерий часто встречается образование слизи. Внеклеточная слизь помогает сохранению протонного градиента, поддержанию протондвижущей силы и мембранного потенциала. Однако более важна роль слизи в сохранении воды при высыхании и участие ее в прикреплении клеток к поверхностям, имеющем, по-видимому, большое значение для обеспечения субстратом при его низкой концентрации.
4. Снижение числа микробных клеток вследствие выедания консументами или лизиса под действием бактериофагов
Приросту численности микробных клеток противодействуют в природе выедание, фаговая инфекция и гибель в результате голодания. В водных местообитаниях бактериальные популяции выедаются простейшими, а также коловратками и некоторыми веслоногими рачками. Ресничные инфузории, жгутиконосцы и веслоногие питаются взвешенными бактериальными клетками, отцеживая их из свободной воды, тогда как амебы, коловратки и нематоды поедают преимущественно прикрепленные бактериальные клетки. Прикрепление к поверхностям - одна из стратегий, позволяющих избежать выедания животными, питающимися бактериями.
В то же время заметные агрегаты бактерий на разлагающемся детрите поедают более крупные животные, в том числе питающиеся планктоном рыбы, лишенные приспособлений для фильтрации воды.
Выедание снижает величину бактериальной популяции и на первый взгляд кажется повреждающим фактором. Однако уменьшение популяции приводит также к ослаблению конкуренции за субстраты и, таким образом, способствует повышению концентрации субстрата, его обороту и скорости роста бактерий, поддерживая микробную популяцию в активном состоянии. Таким образом, размеры бактериальной популяции зависят как от поступления питательных веществ, так и от выедания, и оба эти фактора влияют один на другой через бактериальную популяцию.
Питающиеся бактериями животные превращают микробную биомассу в животную биомассу с эффективностью, по данным лабораторных экспериментов, примерно 50%. Это означает, что половина биомассы-пищи минерализуется, обеспечивая энергию для ассимиляции другой ее половины животным-консументом.
Названные выше животные, питающиеся бактериями, относятся к аэробам, т.е. проявляют активность в аэробных местообитаниях; о значении питания бактериями в анаэробных средах мало что известно. С открытием факультативно или строго анаэробных ресничных простейших, жгутиконосцев и грибов, обитающих в бескислородных осадках, рубце жвачных животных и других подобных местообитаниях, возник вопрос о роли этих организмов в регуляции численности бактерий в анаэробных сообществах. Опыты по кормлению анаэробных ресничных инфузорий из бескислородных вод высокоэвтрофных озер показали, что эффективность их питания значительно ниже (составляет примерно 5%) по сравнению с аэробными ресничными инфузориями, вследствие низкого энергетического выхода. Таким образом, в анаэробных средах могут поддерживаться лишь незначительные популяции простейших, питающихся бактериями. Питание анаэробных животных и соответственно величина их популяций лимитированы также из-за прикрепления бактерий к поверхностям, особенно в осадках.
Вклад в регуляцию численности бактерий в природных популяциях вносят также бактериофаги. В последние годы становятся известными все новые их виды, и можно предполагать, что ни один из ныне известных видов бактерий не защищен полностью от поражения фагами.
Значение бактериофагов как факторов контроля бактериальных популяций в природе, возможно, проявляется лишь в некоторых ситуациях, например если генетически однородные популяции бактерий-хозяев достигают высокой плотности, как при цветении морских цианобактерий, когда гибель клеток на 50% обусловлена фаговой инфекцией. Популяции, например гетеротрофных бактерий в толще воды, слишком немногочисленны и слишком гетерогенны для того, чтобы численность фагов поддерживалась на достаточно высоком уровне, позволяющем им влиять на численность этих бактерий-хозяев. По предварительным оценкам, гибель клеток бактерий всего на 5 - 10% вызвана лизисом под действием фагов. О значении фагов в почвах или осадках данных пока не имеется, поскольку чрезвычайно сложно проводить микроскопическое исследование этих местообитаний.
5. Методы количественного анализа микробной популяции в природе
Для количественной оценки микробных сообществ в природе необходимы специальные методы, отличные от используемых при изучении лабораторных культур. Прямой подсчет клеток под микроскопом на первый взгляд может казаться весьма подходящим методом, но на самом деле он применим только для анализа проб воды. Однако даже в такой среде большинство бактерий прикреплено к частицам детрита и едва различимо при непосредственной микроскопии. Чтобы визуализировать бактериальные клетки в пробах воды, их окрашивают флуоресцентными красителями, такими как акридиновый оранжевый или 4', 6-диамидино-2-фенилиндол (ДАФИ). Эти красители проникают через плазматическую мембрану и связываются либо с клеточными белками (акридиновый оранжевый), либо с двухцепочечной ДНК (ДАФИ), обеспечивая специфическое окрашивание бактериальных клеток. Однако вопреки более ранним сведениям эти красители не позволяют различать живые и мертвые клетки и среди подсчитанных с их помощью клеток может быть значительная доля мертвых. Имеется возможность специфически выявлять активно дышащие бактерии, используя новые красители, которые образуют флуоресцентные производные только после восстановления дыхательными ферментами (например, 5-циано - 2,3 - дитолил-тетразолийхлорид). Прямой подсчет с применением флуоресцентных красителей не пригоден, однако, как метод для исследования образцов осадков или почв, поскольку в этих средах слишком велик фон естественно флуоресцирующих соединений.
Другие методы, позволяющие выявлять метаболически активные клетки, основаны на применении радиоактивных меток и радиоавтографии. Для определения синтеза белка и роста клеток используют 14С-лейцин, синтеза ДНК и размножения клеток - 3Н-тимидин. Оба эти маркера использовались в прошлом главным образом для изучения проб воды и осадков, но получаемые таким способом данные нельзя считать точными, поскольку внесенный меченый предшественник частично разлагается микробами и доступная в результате информация не соизмерима с усилиями, затраченными на эксперименты.
Оценка численности клеток в бактериальных популяциях чашечным методом Коха, т.е. путем высева на плотные среды в чашках Петри и культивирования, даже при использовании сложных и относительно неспецифических сред дает весьма разочаровывающие результаты. Общее число колоний, например на казеино-крахмало-пептонном агаре, применяемом в качестве
стандартной среды для учета пресноводных бактерий, обычно на 1-2 порядка ниже, чем количество клеток, определяемое путем прямого микроскопирования. Это означает, что лишь 1 - 10% клеток микробного сообщества могут давать колонии при использовании данной методики, и другие среды в этом отношении отнюдь не лучше.
Другой метод количественного учета клеток с помощью культивирования - это метод наиболее вероятного числа. Для определения числа микробов этим способом готовят последовательные разведения (1:10) исследуемого материала в пробирках с жидкой питательной средой не менее чем в трех повторностях и инкубируют пробирки в течение времени, необходимого для проявления роста (помутнения среды). Предполагая, что в последней пробирке, где после достаточного периода инкубации наблюдается рост, находилась исходно одна-единственная клетка, подсчитывают исходное число бактерий в образце. Преимущество данного метода состоит в том, что в жидкой среде в отсутствие контакта с воздухом могут расти даже довольно чувствительные к О2 бактерии, а также в том, что непосредственно в пробирках с разведениями можно определять, например, продукты метаболизма. Недостатком такого подсчета клеток является значительная статистическая неопределенность, связанная с оценкой результатов по принципу «да» или «нет» в трех независимых повторностях разведений.
Культивирование позволяет получить более достоверные сведения, если оно применяется для количественного определения конкретных метаболических групп бактерий. Так, метаногенные бактерии, растущие с использованием водорода/формиата, можно непосредственно подсчитывать в виде колоний в чашках Петри благодаря естественной флуоресценции, выявляя таким образом 20-50% клеток их популяции. Сульфатредуцирующие бактерии также довольно успешно подсчитываются путем культивирования с применением адекватных сред.
Все эти подсчеты - путем прямой микроскопии или с помощью культивирования - имеют в основе допущение, что микробные клетки распределены как отдельные единицы и в этом виде различимы оптически либо по признаку роста. Однако в природных местообитаниях микробы часто образуют более или менее крупные агрегаты или прикрепляются к поверхностям, в том числе к частицам растительного или животного детрита, осадков или почвы, поэтому для их количественного учета с использованием любого из вышеупомянутых методов необходимо предварительно отделить клетки от субстратов (поверхностей), не нарушая жизнеспособности. Возможные способы такого отделения - это встряхивание, гомогенизация или мягкая обработка проб ультразвуком в присутствии пирофосфата, хелатирующих агентов либо детергентов. Следует, однако, учитывать, что эти процедуры вызовут гибель некоторых бактерий и пригодны лишь в качестве компромиссного решения.
Совершенно иной подход к анализу природных популяций состоит в том, что в качестве показателей биомассы используются клеточные компоненты (химические маркеры). Общую живую биомассу (в действительности почти в любой экосистеме она представлена главным образом микробной биомассой) можно количественно оценить, например в почвенном образце, путем определения общего содержания АТР. Показателем биомассы может служить также общее количество ДНК при условии, что процедура экстракции позволяет отделить ДНК из живых клеток от ДНК мертвых клеток, прикрепленных к почвенным частицам. В почвенной микробиологии довольно широко применяется метод фумигации, который состоит в том, что образец подвергают обработке парами хлороформа, при которой большая часть микробов погибает. Затем в течение 10 суток измеряют количество СО2, образующегося в результате окисления отмершей биомассы выжившими клетками. Количество СО2 считают показателем исходного содержания количества биомассы. В качестве альтернативного показателя определяют общую дегидрогеназную активность клеток по восстановлению ими солей тетразолия или диметилсульфоксида.
Более специфичная в отношении отдельных таксонов информация может быть получена при анализе специфических клеточных компонентов. Так, специфичной таксономической характеристикой служит профиль клеточных жирных кислот. К сожалению, для определения метаболических групп прокариот этот параметр малоприменим, поскольку лишь немногие из них, подобно сульфатредукторам, характеризуются специфическим составом жирных кислот. Следует учитывать также, что жирнокислотный состав мембранных липидов подвержен изменениям в зависимости от условий среды. Кроме того, этот метод предусматривает сравнение с чистыми культурами исследуемых бактерий, но культивируемые микроорганизмы, как подчеркивалось выше, часто составляют лишь малую и нерепрезентативную фракцию общей популяции в данном образце.
Химическим показателем присутствия грибов в сложном микробном сообществе служит эргостерол.
Для выявления и идентификации определенных типов бактерий в природных образцах применяют флуоресцентные антитела. В зависимости от использованных для их получения антигенов антитела могут быть направлены против клеточных компонентов, специфичных для отдельного штамма, вида или рода, поэтому уровень специфичности