Файл: Бактериальной клетки. Основные морфологические формы бактерий и методы их изучения. Принципы классификации бактерий по Берджи.pdf

семейства, рода и виды.
Принадлежность вирусов к тому или иному семейству (всего их 19) определяется строением и структурой нуклеиновой кислоты, типом симметрии нуклеокапсида, наличием суперкапсидной оболочки.
Принадлежность к тому или иному роду и виду связано с другими биологическими свойствами вирусов: размер вирионов, способность размножаться в культурах ткани и курином эмбрионе, характер изменений, происходящих в клетках под воздействием вирусов, антигенные свойства, пути передачи, круг восприимчивых хозяев.
Вирусы - возбудители болезней человека относятся к 6 семействам
ДНК-овых и 13 семействам РНК-овых вирусов. Краткая характеристика этих семейств приведена в таблицах
Прионы
Прионы – это инфекционные белки ( сиалогликопротеиды) PrP sc, которые являются видоизмененными клеточными белками PrPc , преобразовавшимися вследствие мутаций.
В норме белки PrPc находятся в наружных мембранах клеток организма, их особенно много в нейронах. Эти белки принимают участие в межклеточном узнавании, их функции не выяснены до конца.
Патологические PrP sc, отличаются от нормальных изменением пространственной конфигурации ( третичной и четвертичной) , т.е. являются их изомерами.
Проникнув в нейрон или глиальную клетку, молекула приона PrP sc контактирует с молекулой нормального белка PrPc и изменяет его конфигурацию, передавая ему свое патогенное состояние.
Таким образом, нормальный белок превращается в патологический прион. Этот процесс нарастает в геометрической прогрессии.
Патологические прионные белки устойчивы к действию клеточных протеаз, нечувствительны к интерферону. Они накапливаются в большом количестве, поражая все новые клетки, вызывая дегенерацию, вакуолизацию и массовую гибель нейронов. Развивается губчатая энцефалопатия мозга, часто с образованием амилоидных бляшек.
Виройды:
Виро́иды (англ. Viroids) — инфекционные агенты, состоящие только из кольцевой РНК. Они вызывают различные болезни растений, в том числе веретеновидность клубней картофеля, экзокортис цитрусовых[en] и карликовость хризантемы. По оценкам учёных, более трети вирусных заболеваний растений вызываются вироидами[3].
Вироиды представляют собой ковалентно замкнутые кольцевые одноцепочечные молекулы РНК
(оцРНК) длиной от 246 до 467 нуклеотидов[4] (для сравнения: геном мельчайшего из известных вирусов составляет 2000 нуклеотидов в длину[3]). В отличие от вирусов, вироиды лишены белковой оболочки (капсида). Обычно кольцевая РНК вироидов существует в виде палочковидной формы из- за спаривания азотистых оснований внутри цепи, в результате чего образуются двухцепочечные участки с одноцепочечными петлями. Некоторые вироиды находятся в ядрышке инфицированной

клетки, где может присутствовать от 200 до 100 000 копий генома вироида. Другие вироиды располагаются в хлоропластах.
РНК вироидов не кодирует каких-либо белков, поэтому вироиды не могут реплицироваться сами по себе. Предполагается, что для этих целей они используют ДНК-зависимую РНК-полимеразу хозяйской клетки — фермент, который обычно используется для синтеза РНК на матрице ДНК.
Однако в инфицированной вироидом клетке этот фермент использует РНК вироида, а не ДНК клетки-хозяина, как матрицу для синтеза РНК. Эта молекула РНК, комплементарная геному вироида, используется как матрица для синтеза новых РНК вироида[5].

27. Методы диагностики вирусных инфекций
Современная вирусология располагает широким набором методов диагностики вирусных инфекций.
Это:
Вирусоскопическое исследование;
Вирусологическое исследование;
Методы серодиагностики;
Методы Иммуноиндикации;
Молекулярно-генетические методы.
Выбор метода лабораторной диагностики определяется характером заболевания, периодом болезни и возможностями лаборатории.
1. Вирусоскопическое исследование.
Целью его является обнаружение при микроскопии исследуемого материала внутриклеточных включений, а в отдельных случаях при электронной микроскопии - вирионов. Обнаружение включений Бабеша-Негри при оптической микроскопии патологического материала применяется, например, для диагностики бешенства. Для диагностики ротавирусной инфекции используют электронную микроскопию фекалий, при которой можно обнаружить типичные по морфологии вирионы.
2. Вирусологическое исследование.
Целью его является выделение вирусов и их идентификация. Этот метод является наиболее достоверным для доказательства этиологической природы заболевания. Вирусологическое исследование наиболее информативно.
Однако, необходимо помнить, что само по себе выделение вируса из организма даже больного человека не всегда может свидетельствовать о его этиологической роли. Только при тщательном сопоставлении с данными клиники, эпидемиологического анамнеза, результатами серологических реакций результаты вирусологического исследования приобретают соответствующее значение.
Это положение приобретает особенно большое значение в связи сналичием большого числа латентных и персистирующих вирусов.
Алгоритм вирусологического исследования.
I. Выделение вируса с помощью различных методов культивирования.
II. Идентификация вируса до уровня: семейства, вида, внутривидовая.
I. Выделение вируса.
Для выделения вируса от больных могут быть использованы разные методы культивирования.
1. Культивирование в организме восприимчивых животных.
2. Культивирование в развивающихся куриных эмбрионах.
3. Культивирование в культуре ткани
Наибольшее распространение получили первично-трипсинизированные культуры эпителиальной и соединительной тканей, клетки которых в виде монослоя прикрепляются к стенкам пробирок.
Для поддержания жизнедеятельности клеток культуры ткани используют специальные питательные среды, содержащие полный набор веществ необходимых для роста клеток.
Первично-трипсинизированные культуры клеток готовят из эмбриональных тканей человека, кур, мышей. Эмбриональные ткани обладаютбольшой потенцией к росту.
Перевиваемые культуры представляют собой штаммы клеток злокачественных опухолей (Hela, Нер-1, Нер-2, Детроит-6). Их рост поддерживается в лабораториях путем последовательных пассажей.

О размножении вируса в культуре ткани судят по следующим критериям.
1. Цитопатическое действие. Оно выражается в различных изменениях морфологии клеток, пикнозе ядер, образовании симпластов (гигантских многоядерных клеток), полной деструкции монослоя.
2. Внутриклеточные включения. Вирусы в зараженных клетках могут вызывать образование внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме или ядре пораженных клеток.
3. Метод цветной пробы. Клетки культуры ткани культивируют в питательной среде с индикатором. При росте незараженных клеток они образуют кислые продукты метаболизма, и индикатор меняет цвет питательной среды. Репродукция вируса в клетках культуры ткани нарушает метаболизм клеток, кислых продуктов не образуется, и цвет среды не изменяется.
4. Феномен гемадсорбции. На поверхности клеток, зараженных вирусами, синтезирующими гемагглютинин, экспрессируются значительные его количества, и эти клетки приобретают способность адсорбировать эритроциты.
5. Феномен гемагглютинации. При размножении в культуре ткани гемагглютинирующих вирусов культуральная жидкость (в ней накапливаются новые вирионы) приобретает способность агглютинировать эритроциты.
6. Бляшки под агаром. На газоне однослойной культуры ткани, залитой агаром, формируются негативные колонии.
II. Идентификация выделенных вирусов.
Первичную идентификацию вируса до уровня семейства можно провести с помощью набора следующих тестов:
Определение типа НК - проба с бромдезоксиуридином;
Определение наличия суперкапсидной оболочки - проба с эфиром;
Определение размеров вирионов - фильтрование через фильтры с диаметром пор 50 и 100 нм;
Синтез гемагглютинина - реакция гемагглютинации.
Оценку результатов проводят путем заражения культуры ткани пробой, подвергнутой соответствующей (1, 2, 3) обработке, с последующим учетом результатов заражения по цветной пробе.
Идентификация вируса до вида, внутривидовая идентификация может быть проведена разными методами. Чаще всего для этого используют реакцию вируснейтрализации с соответствующими иммунными противовирусными сыворотками. После обработки такими сыворотками вирусы теряют свою биологическую активность (нейтрализуются).
Об этом судят по: результатам РТГА; цветной пробе; отсутствию цитопатического действия; выживаемости чувствительных животных; отсутствию изменений при заражении куриных эмбрионов.
Для идентификации выделенных от больного вирусов могут быть использованы методы молекулярной гибридизации (МГ).
3. Серодиагностика.
Серодиагностика вирусных инфекций используется для обнаружения в сыворотке обследуемого АТ и нарастания их титра. Для этого используют различные реакции иммунитета, чаще всего это РСК,
ИФА, РТГА. Реакции ставят с известными вирусными диагностикумами. Обязательно исследование парных сывороток для выявления нарастания титра инфекционных антител.

4. Иммуноиндикация.
Для иммуноиндикации вирусных антигенов в патологическом материале используют различные варианты реакций иммунитета 2 и 3 поколений (РПГА, РИФ, ИФА, РТПГА и др.). Известным компонентом реакций являются иммунные противовирусные сыворотки.
5. Молекулярно-генетические методы.
Эти методы широко используют как для диагностики вирусных инфекций, так и для анализа вирусных ДНК и РНК и их взаимодействий. В первую очередь МГМ применяются для выявления персистирующих вирусов, находящихся в клиническом материале, которые с трудом или вообще не обнаруживаются другими методами. Эти методы достаточно просты и позволяют быстро обнаруживать НК или ее фрагменты.
Существует две разновидности МГМов - ДНК-зондирование (ДНК-
гибридизация) и ПЦР.
Метод ДНК-гибридизации основан на способности денатурированной одноцепочечной ДНК достраивать гомологичную цепь в бесклеточной системе. В качестве материала для этой второй нити используют лабораторно приготовленные фрагменты молекулы ДНК, гомологичные фрагментам
ДНК искомых вирусов. Их называют ДНК-зонды. Медицинская промышленность выпускает различные типы ДНК-зондов. Для регистрации включения зонда в ДНК вируса, если она присутствует в исследуемом материале, зонд метят либо радиактивной, либо ферментной меткой. В последнем варианте при добавлении субстрата возникает окраска,видимая невооруженным глазом.
В основе ПЦР лежит способность молекул НК и ее фрагментов при определенных условиях нарабатывать неограниченное число копий, чтопозволяет существенно облегчить их выявление.

28. Типы взаимодействия вируса с клеткой. Продуктивная вирусная
инфекция.
Выделяют следующие типы взаимодействия вируса и клетки.
Продуктивная вирусная инфекция. При таком типе взаимодействия вируса с клеткой происходит репродукция вируса, а клетка-хозяин погибает. Продуктивная инфекция лежит в основе острых
вирусных заболеваний.
Абортивная вирусная инфекция. При таком типе взаимодействия репродукция вируса нарушается
(не происходит), при этом клетка избавляется от вируса, не нарушая своих функций.
Латентная вирусная инфекция. При таком типе взаимодействия происходит репродукция вируса, но клетка не погибает и сохраняет свою жизнеспособность. В ней происходит синтез и вирусных и клеточных компонентов. При этом синтез клеточных компонентов преобладает, и поэтому клетка способна долго сохранять свои свойства. Данный механизм лежит в основе безусловных латентных
вирусных инфекций.
Условные латентные вирусные инфекции. При таком типе взаимодействия вируса с клеткой погибают не все клетки пораженного органа, а только их часть. Остальные неповрежденные клетки этого органа компенсируют некоторую утрату его функций, вследствие чего заболевание некоторое время не проявляется, пока не наступит декомпенсация.
Вирус-индуцированная трансформация. Это такой тип взаимодействия вируса с клеткой, при котором клетки, пораженные вирусом, приобретают новые, ранее не присущие им свойства. При этом геном вируса (или его часть) встраивается в геном клетки. Такой интегрированный в хромосому клетки-хозяина вирусный геном называется провирусом.
Продуктивная вирусная инфекция
Основные этапы продуктивной вирусной инфекции:
1. Адсорбция вируса на поверхности клетки.
2. Проникновение вируса в клетку.
3. Депротеинизация вириона.
4. Экспрессия вирусного генома.
5. Морфогенез.
6. Выход вирионов из клетки.
Первый, второй и третий этапы лежат в основе подготовки вируса к процессам репродукции, в которых в соответствии с программой, заложенной в геноме вируса, происходят процессы воспроизведения нового поколения вирусов и выхода вирусов из клетки.
1-й этап – адсорбция вируса на поверхности клетки. На данном этапе адсорбция носит неспецифический характер, она обусловлена илой ионного притяжения между вирусом и клеткой.
Следующая фаза – специфическая, осуществляется за счет специфических рецепторов клетки и прикрепительных белков на поверхности вируса – у простых вирусов и белков гликопротеинов – у сложных вирусов.

2. Слияние суперкапсидной оболочки вируса и мембраны клетки.
Рецепторный эндоцитоз. На первом этапе вирус связывается поверхностными белками с рецепторами клеток. В месте адсорбции вируса клеточная мембрана впячивается с образование эндосомы, содержащей вирус.
При реализации последующих процессов эндосома объединяется с протоплазматической вакуолью и клеточной лизосомой, что приводит к образованию рецептосомы и последующему выходу генетического материала в клетку. Таким способом в клетку проникают простые вирусы.
Слияние мембран суперкапсидной оболочки вируса и клетки. Сложные вирусы проникают в клетку путем слияния их оболочки, а также при помощи специального суперкапсидного белка слияния – F- белка, который способен напрямую связаться с определенными элементами плазматической мембраны, открывая вирусу путь внутрь клетки.
3-й этап – депротеинизация и «раздевание» вируса. Эта фаза необходима, чтобы обеспечить следующие этапы транскрипции и трансляции вирусного генома. Процесс «раздевания» вируса и процесс выхода вируса из капсидной оболочки – это запрограммированный процесс, пусковым моментом которого является контакт вируса с рецепторами клетки. Конечным продутом
«раздевания» является освобожденная нуклеиновая кислота.
Разные вирусы имеют свои специализированные участки «раздевания» в клетке: пикорнавирусы – в цитоплазме; герпесвирусы – в околоядерном пространстве и ядре. После процессов «раздевания» генетический аппарат вируса проникает в цитоплазму клетки хозяина.
4-й этап– экспрессия вирусного генома. Следующей стадией репродукции является синтез белков и нуклеиновых кислот, который разобщен во времени и пространстве – дизъюнктивная
репродукция. Процессы, связанные с реализацией генетической программы вируса, осуществляются в соответствии с процессами трансляции и репликации вирусного генома. Эти процессы протекают различно, это обусловлено биологическими особенностями вируса.
ВИРУСЫ С ДВУНИТЕВОЙ ДНК. Цепь происходящих событий универсальна: геномная ДНК транскрибируется в ядре клетки при участии клеточной РНК-полимеразы. Образовавшаяся и-РНК транслируется, и в результате образуется белок вируса.
СХЕМА: геномная ДНК вируса → транскрипция и-РНК → трансляция → белок вируса.
РНК (+) - ГЕНОМНЫЕ ВИРУСЫ. Геном этих вирусов выполняет также функцию и-РНК. В ходе процесса он распознается и транслируется рибосомами с образованием гигантского полипептида- предшественника, который в дальнейшем под действием протеаз нарезается на отдельные структурные и неструктурные белки.
СХЕМА: геномная (+)РНК вируса → трансляция → образование белка вируса.
РНК(-) - ГЕНОМНЫЕ ВИРУСЫ. Вирусы, имеющие РНК(-)- геном, который выполняет роль матрицы, с которой происходит транскрипция и-РНК (с участием ДНК-полимеразы) с последующей трансляцией белка вируса.
СХЕМА: геномная РНК(-) вируса → транскрипция → и-РНК →трансляция белка вируса.
5-й этап – морфогенез. Формирование вирионов происходит:
1. Путем самосборки при взаимодействии НК вируса и капсидных белков. Результатом является формирование нуклеокапсида. Это характерно для простых вирусов.
2. Сложные вирусы проходят процесс формирования последовательно: сначала происходит формирование нуклеокапсида, затем образовавшаяся структура покрывается суперкапсидной оболочкой и между капсидной и суперкапсидной оболочкой формируется матриксный слой.
6-й этап – выход вирионов из клетки. Репродукция вирусов колеблется от 6 до 8 часов и заканчивается выходом вируса из клетки, который может проходить следующими путями: