Файл: Н. И. Пирогова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.pdf
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 01.12.2023
Просмотров: 122
Скачиваний: 1
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
10
В изоэлектрическом состоянии белок представляет собой диполярный полиион:
(H
3
N
+
)
n
–Pt–(COO
–
)
m
(n m)
Значения ИЭТ различных белков зависят от соотношения кислотных и основных групп в макромолекулах. Чем больше групп COOH, тем ниже значение ИЭТ и, наоборот, чем меньше этих групп, тем выше ИЭТ. Это обьясняется так: для приведения белка, допустим, с преобладанием кислотных групп, в изоэлектрическое состояние, необходимо создать определенную концентрацию ионов H
+
, чтобы подавить диссоциацию избыточного по сравнению с группами –NH
2
числа групп –COOH.
Например, в молекуле фермента желудочного сока пепсина содержатся 71 кислая и 4 основных групп и для достижения ИЭС должна быть подавлена диссоциация 64 групп –COOH, следовательно, требуется высокая концентрация ионов H
+
. Поэтому pI пепсина равна ≈ 1. В гемоглобине 52 кислых и 94 основных групп, соответственно, его pI = 6.8.
По соотношению кислотных и основных групп различают нейтральные белки, для них pI = 5.5 – 7, основные (преобладают основные группы), для которых pI > 7 или кислые (преобладают кислотные группы), для них pI < 5.5 (см. табл. 10.2).
Изоэлектрическая точка большинства белков животных тканей лежит в пределах от 5.5 до 7.0. Однако в природе есть белки, у которых значения изоэлектрической точки находятся при крайних значения pH среды. Например, величина pI пепсина, как было указано выше, равна ≈ 1, а сальмина (основного белка из молок семги) — почти 12.
Для определения изоэлектрических точек белков применяются различные методы. ИЭТ определяют по:
• электрофоретической подвижности (электрофорез — перемещение заряженных частиц в электрическом поле); при pH < pI белок движется к катоду (–), при pH > pI — к аноду (+), а при pH = pI белок неподвижен;
• степени набухания (при pH = pI минимальна);
• растворимости (при pH = pI минимальна);
• высаливанию (при pH = pI максимально);
• скорости застудневания (при pH = pI максимальна);
• вязкости растворов (при pH = pI минимальна);
• осмотическому давлению (при pH = pI минимально).
Таблица 10.2. Характеристики некоторых белков
Белок
М
Число аминокислотных остатков pI
Форма макромолекулы общее основных
(n) кислых
(m) нейтральных
Инсулин
8000 50 6
4 40 8.2 глобулярный
Пепсин
2000 150 4
71 75
1 глобулярный
Альбумин
22000 520 99 126 295 4.7 глобулярный
Гемоглобин 66000 570 94 52 430 6.8 глобулярный
Коллаген
135000 960 85 124 750
6 фибрилярный
Фибриноген 360000
2000
поровну
60%
6.0 фибрилярный
11
Кислотно-основные свойства белков, как полиамфолитов, проявляются в том, что они в зависимости от pH растворов могут находиться в различных формах: белок-кислота (поликатионы), белок-основание (полианионы) и в виде диполярного полииона (белок-соль). При изменении pH происходит превращение одних форм белка в другие, причем эти превращения обратимы в определенных границах изменения pH (схема 10.3). pH = ИЭТ (pI)
диполярный полиион "белок-соль"
изоэлектрическое состояние (ИЭС)
− mH
− nH
(H
3
N)
n
Pt(COOH)
m
(H
3
N)
n
Pt(COO)
m
(H
2
N)
n
Pt(COO)
m
анионные формы "белок-основание"
pH > pI
(полианионы)
(поликатионы)
катионные формы "белок-кислота"
pH < pI
Схема 10.3. Кислотно-основные свойства белков
Своеобразие белков-полиамфолитов проявляется также в самопроизвольном образовании ими лиофильных термодинамически устойчивых растворов и, что особенно важно, в зависимости пространственной формы макромолекул от pH растворов.
В водных растворах белков диполи воды определенным образом ориентируются вокруг заряженных групп –COO
–
и –NH
3
+
и образуют гидратные оболочки макромолекул, создавая плавный переход от органических молекул к неорганическому растворителю, что делает макромолекулы лиофильными (гидрофильными), а чем лиофильнее частицы в системе, тем она термодинамически устойчивее.
Влияние кислотности среды на пространственную форму макромолекул определяет зависимость практически всех физико-химических свойств растворов белков от pH. В изоэлектрическом состоянии гибкие макромолекулы свернуты в более или менее компактные клубки вследствие взаимного притяжения разноименных зарядов. В более кислой или более щелочной (по сравнению с pI) среде в макромолекуле преобладают заряды одного знака и в результате их взаимного отталкивания молекулы претерпевают конформационные изменения, разворачиваются и находятся в растворе в виде длинных гибких цепочек (рис. 10.5). pH < pI
pH = pI
pH > pI
Рис. 10.5. Влияние pH среды на пространственную форму макромолекул
В соответствии с такими изменениями форм макромолекул физико- химические свойства растворов белков, как уже упоминалось, проходят через экстремальные значения в изоэлектрической точке: осмотическое давление и вязкость, набухание и растворимость минимальны в ИЭТ, скорость застудневания и высаливание в ИЭТ максимальны.
12
ГЛАВА 11
ОБРАЗОВАНИЕ РАСТВОРОВ ВМС
11.1. Набухание
Взаимодействие полимеров с растворителями начинается с набухания, предшествующего образованию растворов ВМС.
Набухание — это самопроизвольный процесс избирательного поглощения низкомолекулярного растворителя высокомолекулярным соединением за счет односторонней диффузии растворителя, сопровождающийся увеличением массы и объема полимера.
Процесс набухания обычно протекает в две стадии.
Первая стадия. Полимер поглощает до 20 – 30% (от массы сухого полимера) растворителя. Движущей силой первой стадии является диффузия молекул низкомолекулярного растворителя в ВМС. В случае набухания белков в воде происходит гидратация макромолекул, обусловленная электростатическим взаимодействием диполей воды и зарядов макромолекул, возникающих при ионизации различных функциональных групп. Диполи воды в гидратных оболочках определенным образом ориентированы и структурированы
(упорядочены и уплотнены).
Образование
гидратной
оболочки сопровождается выделением тепла (теплота набухания). Вода, образующая гидратные оболочки, называется "связанной", она обладает такими же химическими свойствами, как и обычная, но вследствие своей структурированности отличается физическими: меньшей упругостью пара, худшей растворяющей способностью, повышенной плотностью (до 1.2 –
1.4 г/мл), пониженной температурой замерзания (до –20 C) и т. д. Чем больше гидрофильность белка, тем большее количество воды он связывает. Например, в студне желатина масса связанной воды в 2 раза больше массы сухого белка.
Объем системы ВМС — вода на первой стадии набухания не увеличивается, а, как правило, даже уменьшается, такое явление называется контракцией.
Причинами контракции являются: ориентация молекул воды в гидратных оболочках, что приводит к уплотнению системы, а также проникновение молекул воды в промежутки между макромолекулами, ведущее к большей компактности системы.
Вторая стадия. На второй стадии набухание происходит без выделения теплоты, поглощается до 70 – 80% (от массы сухого полимера) воды; это "свободная" вода, в которой растворяется гидратированный белок. Движущей силой второй стадии является осмос, так как гидратированный белок представляет собой полупроницаемую мембрану. Происходит увеличение объема белка, связи между макромолекулами ослабевают, возрастает число свободных конформаций макромолекул. Расстояния между макромолекулами увеличиваются, отдельные макромолекулы отрываются от набухшего белка и медленно диффундируют в растворитель. Если что-либо препятствует увеличению объема системы, возникает
давление набухания (до 100 – 1000 атм).
13 а
б в
г д
Рис. 11.1. Стадии набухания а — система белок + вода до набухания; б — первая стадия набухания, наблюдается контракция; в — вторая стадия набухания, наблюдается увеличение объема белка; г — вторая стадия набухания с частичным растворением белка; д — образовался раствор белка
Набухание полимеров характеризуется степенью набухания(
):
0 0
100
m
m
m
−
=
(%) или
0 0
100
V
V
V
−
=
(%), где m и V, соответственно, масса и объем ВМС после набухания; m
0
и V
0
— масса и объем ВМС до набухания.
Степень набухания может изменяться от десятков до тысяч процентов; для биополимеров степень набухания обычно не превышает 1600%.
Различают неограниченное и ограниченное набухание. В случае неограниченного набухания полимер поглощает растворитель, затем при той же температуре постепенно переходит в раствор, т. е. происходит растворение полимера. При ограниченном набухании процесс останавливается на второй стадии набухания независимо от времени пребывания полимера в растворителе, при этом образуется студень.
Причинами ограниченного набухания могут быть:
• ограниченная растворимость ВМС в растворителе вследствие отсутствия сродства между ними, например, по полярности, так, неполярный натуральный каучук в полярном спирте набухает ограниченно;
• наличие мостиковых связей между макромолекулами, например, дисульфидных мостиков –S–S– в вулканизированном каучуке, которые не позволяют макромолекулам отделяться друг от друга и переходить в раствор.
Иногда между ограниченным и неограниченным набуханием нельзя провести четкую границу, так как полимер ограниченно набухающий в одних условиях, может неограниченно набухать в других: желатин в холодной воде набухает ограниченно и неограниченно — в теплой.
11.2. Термодинамика набухания и растворения ВМС
На первой стадии набухания за счет взаимодействия молекул растворителя с макромолекулами выделяется теплота, следовательно, энтальпия системы
уменьшается (H < 0). Вторая стадия набухания сопровождается ростом
числа свободных конформаций макромолекул, что ведет к значительному росту энтропии (S > 0). Энтальпия системы на второй стадии набухания практически не изменяется (H 0). При неограниченном набухании образуется раствор ВМС, макромолекулы принимают максимально возможное