Файл: Учреждение образования полесский государственный университет в. Т. Чещевик молекулярные основы.pdf

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 89 2) транзитная зона;
3) зона поляризующей активности.
Апикальный эктодермальный гребень. Спецификация зоны апикального эктодермального гребня предшествует образованию почки конечности, когда под влиянием сигналов промежуточной и латеральной мезодермы, в эктодерме морфогенетического поля конечности устанавливается экспрессия генов, предопределяющих дорсальную и вентральную сторону покровов будущей конечности. В клетках апикального эктодермального гребня происходит экспрессия гена msx 2 (muscle segment homeobox), что активирует пролиферацию в подлежащей мезенхиме, в которой экспрессируется другой ген этого же семейства – msx 1. Высокий уровень пролиферации в мезенхиме дистальной области почки конечности поддерживается достаточно сложной системой факторов, в которой участвуют разнообразные факторы роста фибробластов (FGF 8). Функция АЭГ состоит в поддержании высокого пролиферативного статуса мезенхимы транзитной зоны.
Транзитная зона.
Данная зона определяет спецификацию проксимодистальной оси конечности. Чем меньше времени клетки находятся в транзитной зоне, тем более проксимальные элементы конечности они формируют. В развитии конечности различаются три фазы, каждая из которых связана с детерминацией соответственно стилоподия, зигоподия и аутоподия. У мыши первая фаза характеризуется экспрессией генов hoxd 9 и hoxd 10, которая охватывает всю почку в целом. Во второй фазе формирования конечности устанавливается гнездовой паттерн экспрессии hoxd генов: в задней области представлены мРНК транскрипты всех пяти экспрессирующихся в конечности генов (hoxd9 - hoxd13). Далее вперед расположена зона экспрессии генов hoxd9
- hoxd12. Затем идет полоска, в которой имеются транскрипты лишь трех генов hoxd9 - hoxd11. В следующей, сдвинутой в переднем направлении зоне экспрессируются гены hoxd9 и hoxd10. И, наконец, в передней области конечности экспрессируется лишь один ген – hoxd9. Третья фаза характеризуется тем, что в дистальной части конечности начинает повсеместно экспрессироваться hoxd13, несколько отступя назад проходит граница экспрессии гена hoxd13, тогда как в задней дистальной области сохраняется экспрессия генов hoxd10 - hoxd13.
Зона поляризующей активности (ЗПА). Данная зона, расположенная на заднем краю ранней почки конечности, участвует в установлении переднезадней оси конечности. Ключевым событием, определяющим свойства
ЗПА, является включение экспрессии гена sonic hedgehog (shh). Активность shh инициирует синтез белков BMP (BMP 2 и BMP 7). Эти белки, диффундируя из

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 90 зоны поляризующей активности, создают заднепередний градиент, который обуславливает дифференциальную активность генов hoxd кластера, наблюдаемой во второй фазе развития конечности.
Важную роль в морфогенезе конечности позвоночных играет апоптоз. В конечности с помощью апоптоза устраняются клетки, которые расположены в межпальцевых промежутках, а также клетки, занимающие центральную область зигоподия. В результате самоуничтожения клеток здесь образуются два обособленных хрящевых зачатка зигоподия. Апоптоз в конечности инициируется белками семейства BMP – BMP2, BMP4 и BMP7.
Поддержание жизнеспособности клеток зачатка обеспечивается белком noggin, антагонистом BMP.

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 91
ТЕМА 18
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ АПОПТОЗА
1. Сущность явления апоптоза – программируемой клеточной гибели,
отличия апоптоза и некроза.
2. Механизмы активации процесса (рецептор-опосредованный и
митохондриальный пути развития клеточной гибели), основные
участники процесса.
3. Роль апоптоза в развитии и в физиологических процессах во
взрослом организме.
1. Сущность явления апоптоза – запрограммированной
клеточной гибели, отличия апоптоза и некроза
Апоптоз – запрограмированная клеточная смерть, регулируемый процесс самоликвидации на клеточном уровне, в результате которого клетка фрагментируется на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. Фрагменты погибшей клетки обычно очень быстро
(в среднем за 90 минут) фагоцитируются макрофагами либо соседними клетками, минуя развитие воспалительной реакции. Морфологически регистрируемый процесс апоптоза продолжается 1–3 часа. Апоптоз наблюдается у всех эукариотов, начиная от одноклеточных простейших и вплоть до высших организмов. В программируемой смерти прокариотов участвуют функциональные аналоги эукариотических белков апоптоза.
Функции:
1) уничтожение дефектных (повреждённых, мутантных, инфицированных) клеток;
2) участие в процессах дифференциации и морфогенеза;
3) поддержание клеточного гомеостаза;
4) участие в развитии и функционировании иммунной системы.
Отличия некроза и апоптоза:
• Апоптоз запускается физиологическими факторами, например, активацией белка р53, а некроз – нефизиологическими, например, механическим повреждением, атакой комплемента, длительным отсутствием кислорода.

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 92
• Апоптоз – это генетически запрограммированный активный процесс, требующий затраты АТФ, а некроз – пассивный процесс, может происходить при +4°.
• При апоптозе клетка сморщивается и распадается на фрагменты, окруженные плазматической мембраной («апоптозные тельца»), их поглощают соседние клетки или фагоциты. При некрозе клеточная мембрана разрушается, содержимое клетки выливается в межклеточную жидкость, что приводит к развитию воспаления (покраснение, опухоль, жар, боль), повреждаются соседние клетки.
2. Механизмы активации процесса (рецептор-
опосредованный и митохондриальный пути развития клеточной
гибели), основные участники процесса
Процесс апоптоза можно условно разделить на три фазы: сигнальную
(индукторную), эффекторную и деградационную (фаза экзекуции или деструкции).
Сигнальная фаза. Инициация апоптоза может происходить посредством внешних (внеклеточных) или внутриклеточных факторов. Выделяют два основных пути трансдукции (передачи) сигнала апоптоза: рецептор-зависимый сигнальный путь с участием рецепторов гибели клетки и митохондриальный путь.
Рецептор-зависимый сигнальный путь.
Апоптоз начинается с взаимодействия специфических внеклеточных лигандов с рецепторами клеточной гибели, экспрессированными на поверхности клеточной мембраны. Рецепторы, воспринимающие сигнал апоптоза, относятся к суперсемейству TNF-рецепторов. Все рецепторы
«смерти» представляют собой трансмембранные белки, характеризующиеся наличием общей последовательности из 80 аминокислот в цитоплазматическом домене. Данная последовательность называется доменом «смерти» и является необходимой для трансдукции сигнала апоптоза. Внеклеточные участки рецепторов «смерти» взаимодействуют с тримерами лигандов, которые в результате взаимодействия тримеризуют рецепторы «смерти» (то есть
«сшивают» 3 молекулы рецептора). Активированный таким образом рецептор взаимодействует с соответствующим внутриклеточным адаптером (или адаптерами). Для рецептора CD95 (Fas/APO-1) адаптером является FADD (от англ. Fas-associated DD-protein – «белок, взаимодействующий с доменом смерти

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 93
Fas-рецептора»). Для рецепторов TNFR1 и DR3 адаптером является TRADD (от англ. TNFR1-associated DD-protein – «белок, взаимодействующий с доменом смерти TNFR1-рецептора»).
Белок-адаптер, ассоциированный с рецептором «смерти», вступает во взаимодействие с эффекторами – пока ещё неактивными предшественниками протеаз из семейства инициирующих каспаз – с прокаспазами. В результате цепочки взаимодействия «лиганд-рецептор-адаптер-эффектор» формируются агрегаты, в которых происходит активация каспаз. Данные белковые агрегаты именуются апоптосомами, апоптозными шаперонами или сигнальными комплексами, индуцирующими смерть.
Посредством рецепторов «смерти» могут быть активированы три инициирующие каспазы: −2; −8 и −10. Активированные инициирующие каспазы далее участвуют в активации эффекторных каспаз.
Митохондриальный сигнальный путь.
Митохондриальный сигнальный путь апоптоза реализуется в результате выхода апоптогенных белков из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму клетки.
Высвобождение апоптогенных белков может осуществляться двумя путями: за счёт разрыва митохондриальной мембраны или же путём открытия высокопроницаемых каналов на внешней мембране митохондрий.
Разрыв внешней мембраны митохондрий объясняется увеличением объема митохондриального матрикса. Данный процесс связывают с раскрытием пор митохондриальной мембраны, приводящим к снижению мембранного потенциала и высокоамплитудному набуханию митохондрий вследствие осмотического дисбаланса. Поры диаметром 2,6–2,9 нм способны пропускать низкомолекулярные вещества массой до 1,5 кДа. Открытие пор стимулируют следующие факторы: неорганический фосфат; каспазы; тиоловые реагенты; образование активных форм кислорода; разобщение окислительного фосфорилирования протонофорными соединениями; увеличение содержания
Ca
2+
в цитоплазме; воздействие керамида; истощение митохондриального пула
АТФ и др.
В качестве альтернативного пути выхода апоптогенных белков из межмембранного пространства митохондрий рассматривается вариант образования белкового канала во внешней митохондриальной мембране.
В результате митохондриального пути в цитоплазму высвобождаются: цитохром С; прокаспазы −2, −3 и −9; AIF (от англ. apoptosis inducing factor —
«фактор, индуцирующий апоптоз»). Цитохром С в цитоплазме клетки участвует в формировании апоптосомы вместе с белком Apaf-1 (от англ. apoptosis protease

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 94 activating factor-1 — «фактор активации протеаз апоптоза»). Предварительно,
Apaf-1 претерпевает конформационные изменения в результате реакции, протекающей с затратой энергии
АТФ.
Предполагается, что трансформированный Apaf-1 приобретает способность связывать цитохром С.
К тому же открывается доступ CARD-домена Apaf-1 для прокаспазы-9. В итоге происходит олигомеризация 7 субъединиц трансформированного белка Apaf-1 с участием цитохрома С и прокаспазы-9. В результате чего образуется апоптосома, активирующая каспазу-9. Зрелая каспаза-9 связывает и активирует прокаспазу-3 с образованием эффекторной каспазы-3. Кроме того, высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий флавопротеин AIF является эффектором апоптоза, действующим независимо от каспаз.
Реализация апоптоза может происходить в результате комбинированного действия двух основных сигнальных путей – рецептор-зависимого и митохондриального.
Эффекторная фаза.
В течение эффекторной фазы различные инициирующие пути конвертируются в один (или несколько) общий путь апоптоза. Происходит активация каскада белков-эффекторов и регулирующих их белков- модуляторов. Основными эффекторами апоптоза являются каспазы. В процессе активации они запускают каспазный каскад.
Каспазный каскад.
Каспазы представляют собой цистеиновые протеазы, которые расщепляют аминокислотные последовательности после остатка аспарагиновой кислоты.
Каспазы образуются за счёт активации прокаспаз (молекулярная масса 32–56 кДа), в составе которых выделяют 3 домена: регуляторный N-концевой домен
(продомен), большую (17–21 кДа) и малую (10–13 кДа) субъединицы.
Активация происходит путём протеолитического процессинга: все три домена расщепляются, отделяется продомен, а оставшиеся большая и малая субъединицы ассоциируются, образуя гетеродимер. Два гетеродимера в дальнейшем формируют тетрамер – полноценную каспазу с двумя каталитическими участками.
Каспазы, которые участвуют в апоптозе, разделяют на инициаторные (−2,
−8, −9, −10, −12) и эффекторные (−3, −6, −7). Инициаторные каспазы активируют эффекторные каспазы, которые в свою очередь провоцируют и непосредственно участвуют в трансформации клетки. В итоге морфологические и биохимические изменения приводят к гибели клетки по типу апоптоза.
Функции эффекторных каспаз:

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 95 1. Участие в прямом и опосредованном разрушении клеточных структур.
Гидролизу подвергаются белки ядерной ламины (оболочки), разрушается цитоскелет, расщепляются белки, регулирующие клеточную адгезию.
2. Инактивация белков, блокирующих апоптоз. Разрушению подвергаются и антиапоптозные белки семейства Bcl-2.
3. Обуславливают диссоциацию регуляторных и эффекторных доменов, участвующих в репарации ДНК, мРНК-сплайсинга и ДНК-репликации.
Деградационная фаза.
Итогом программируемой клеточной гибели является деградация клетки путём фрагментации на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. Фрагменты погибшей клетки обычно очень быстро
(в среднем за 90 минут) фагоцитируются макрофагами либо соседними клетками, минуя развитие воспалительной реакции.
3. Роль апоптоза в развитии и в физиологических процессах
во взрослом организме
1) Клеточный гомеостаз и морфогенез
Одной из главных функций апоптоза в многоклеточном организме является поддержание клеточного гомеостаза, то есть постоянства клеточной популяции. При этом обеспечивается правильное соотношение численности клеток различных типов, селекция разновидностей клеток внутри популяции, удаление генетически дефектных клеток.
Во взрослом организме программируемая клеточная гибель, уравновешивая митотическое деление, обеспечивает обновление тканей путём поддержания сбалансированной численности клеток.
Апоптоз участвует в формообразовательных процессах, в дифференциации тканей и отдельных частей органов. У животных роль апоптоза в морфогенезе отдельных органов или их частей наиболее отчётливо прослеживается в процессе эмбриогенеза. К примеру, утрата хвоста зародышами амфибий или атрофия у них гипохорды объясняются массовым апоптозом целых клеточных популяций. С другой стороны, уже во взрослом организме, атрофия гормонально-зависимых тканей в условиях снижения концентрации соответствующих гормонов также обусловлена апоптозом.
Например, процессы такого рода периодически протекают в женских половых органах в течение менструального цикла, или же в предстательной железе при снижении концентрации андрогенов. В растительном организме апоптоз интегрирован в процессы морфогенеза и дифференциации.