Технология редактирования генома: текст выступленияКак выяснилось, у бактерий есть своя простая система молекулярного иммунитета, обеспечивающая защиту от внешних врагов. Еще в 1989 г. японские исследователи обнаружили в геноме кишечной палочки участок, содержащий многочисленные повторы. Его назвали CRISPR-локусом, с англ. «clustered regularly interspaced short palindromic repeats» – короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами. Их структура была идентична по нуклеотидным последовательностям, а вот у промежутков, или, как их называют, спейсеров, она оказалась вариабельной и часто была гомологичной последовательностям, обнаруженным в геномах фагов и плазмид. По сути, такой участок – это генетическая память популяции о столкновениях с внешним врагом. Система CRISPR-Cas9 состоит из двух основных частей: некодирующей РНК и ферментов нуклеаз Cаs (от англ. «CRISPRassociated protein» – CRISPR-ассоциированный белок).Наиболее подходящей для функционирования криспер системы является Cas9. Ее макромолекула содержит два критических домена – RuvC и HNH, каждый из которых вносит разрыв только в одну цепочку ДНК. Если в бактериальную клетку проникает фаг, от которого в геноме бактерии остался след, вероятность гибели последнего высока.В каждом определенном локусе все палиндромные повторы одинаковы по строению и включают от 24 до 35 пар нуклеотидов. Длина спейсеров составляет 21–72 от их пары. Они различаются по последовательностям нуклеотидов. К CRISPR-локусу примыкают лидерная нуклеотидная последовательность и гены, кодирующие Cas-нуклеазы. Лидерная последовательность выполняет роль промотора, запускающего транскрипцию CRISPR-локуса, в ходе которой образуется длинная PHК, получившая название пре-crРНК (CRISPR-РНК), а после ее разрезания на фрагменты с помощью Cas9-нуклеаз – просто crРНК. Разрезание двойной нити ДНК осуществляется Cas9-нуклеазой под контролем crРНК и tracrРНК. Роль tracrРНК сводится к поддержанию белка Cas9 в активной форме и сохранению, тем самым, каталитической активности комплекса CRISPR-Cas9. Комплекс crРНК – tracrРНК – Cas9 и есть основное оружие защитной «иммунной» системы бактерий.

---

Благодаря спейсерным участкам в ДНК бактериофага фиксируются комплементарные им нуклеотидные последовательности crРНК, после чего активированные Cas9-нуклеазы их расщепляют. Для успешного действия системы важную роль играет такой генетический компонент, как РАМ (от англ. «protospacer adjancent motif») – короткая, состоящая в среднем из 3 нуклеотидов последовательность, которой фланкирован протоспейсер сайт мишени. Он специфичен для конкретного вида бактерий. Только при наличии PAM комплекс crРНК – tracrРНК – Сas9 распознает мишень и «разрезает» ДНК.

В 2012 г. американский ученый Мартин Джинек с коллегами сумели объединить crРНК и tracrРНК в единую молекулу – sgРНК (с англ. «single guide», сейчас ее называют РНК-гидом или химерной направляющей РНК), они же предложили вектор для ее клонирования. Сродство РНК-гида к нуклеазе Cas9 и его способность направлять фермент к ДНК-мишени оказались такими же высокими, как и у естественных сrРНК и tracrРНК. На практике комплекс «РНК-гид + Cas9 + вектор» подвергают молекулярному клонированию в Е.coli, выделяют из бактерии и вводят его внутрь клетки, геном которой нужно отредактировать.

После элиминации дефекта в гене или всего дефектного гена можно восстановить нуклеотидную последовательность участка ДНК уже в правильном, необходимом ученому виде. Данный процесс можно осуществить несколькими путями. В случае однонитевого разрыва ДНК застройка образовавшейся бреши осуществляется ферментативной системой предрепликативной репарации по принципу комплементарности с использованием в качестве матрицы второй правильной нетронутой цепочки ДНК. В случае же разреза и элиминации двухцепочечного сегмента ДНК для застройки участка генома необходим донорский (искусственно синтезированный) фрагмент ДНК, последовательность которого идентична последовательности интактного гена. Необходимый гомолог участка ДНК вводят в клетку, после чего застройка осуществляется по механизму функционирующей в клетке гомологичной рекомбинации, или HDR (с англ. «homology-directed repair»). Неповрежденный гомолог служит матрицей для восстановления исходной структуры ДНК. Обычно гомологичная рекомбинация в клетке протекает довольно редко. Однако метод CRISPR-Cas9 позволяет увеличить вероятность реализации гомологичной рекомбинации на несколько порядков. Вместе с тем в клетках существует другая система репараций повреждения ДНК, получившая название негомологичного соединения концов NHEJ («non-homologous endjoining»), когда целостность ДНК восстанавливается без достраивания, по причине отсутствия матрицы.

---

Прогресс биологической науки открыл совершенно неожиданные перспективы использования криспер-системы для решения проблемы наследственных заболеваний. При изучении той или иной болезни обычно сталкиваются с одной непреодолимой трудностью, связанной с моделированием патологии. Как оказалось, многочисленные экспериментальные модели заболеваний на животных не воспроизводят всего комплекса генетических и фенотипических особенностей заболевания у людей. Модели полигенных заболеваний, созданные с помощью крисперсистемы, дают возможность определить, нокаут каких генов приводит к тем или иным фенотипическим изменениям в клетках, как из клеток формируются разнообразные ткани с различным генетическим фоном и какие молекулярные события происходят при развитии патологического процесса. На основании подобного рода данных формируются программы создания целых органов.Другая задача, решаемая посредством CRISPR-Cas9,– разработка метода лечения вирусных инфекций, например вируса иммунодефицита человека HIV-1, после которого клетки становятся невосприимчивыми к HIV-1, а также коррекция мутаций, обусловливающих различные наследственные заболевания: муковисцидоз, миодистрофию Дюшена, гемофилию, серповидноклеточную анемию и др.Для коррекции мутаций (причин болезней) стали использоваться индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, которые могут быть получены из любой соматической клетки пациента с наследственным заболеванием. После индукции плюрипотентности эти клетки можно редактировать (исправлять мутации) и/или дифференцировать в различных направлениях, то есть превратить в любую клетку нашего организма. Иными словами, в нашем распоряжении универсальная модельная система для анализа патогенеза заболеваний, помогающая исправить генетические дефекты в модели in vitro и использовать эту информацию при разработке методов лечения.

---

Смотрите также файлы

• Лабораторная работа 1. Изучение движения спутников. Ход работы 1 Получить данные по координатам спутника УниверситетскийТатьяна.docx

• Поволжская академия образования и искусств имени Святителя Алексия, митрополита Московского отче т о прохождении практики.doc

• Описание Российского рынка банковских услуг.docx

• 1. Жиындар жне олара амалдар олдану. Мысал келтірііз. Эйлер Венн диаграммасы бойынша крсетііз.docx

• 3. Распределение заданий по проверяемым предметным способам действия.docx