ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 25.06.2025
Просмотров: 531
Скачиваний: 1
3 2 1 0
С > C > C > C
18 18 18 18
Определение активности липоксигеназы
Фермент липоксигеназа катализирует реакцию:
Ненасыщенная жирная кислота + О2 гидропероксид ненасышенной жирной
кислоты
Полагают, что действию фермента подвергаются лишь те полинасыщенные жирные кислоты, которые содержат цис-цис-1,4-пентадиеновую группу, как показано ниже:
При промежуточном образовании радикалов возникает пероксид; одна двойная связь перемещается в соседнее (коньюгированное) положение, и ненасыщенная жирная кислота переходит в цис-транс-изомер:
Линолевая, линоленовая и арахидоновая кислоты окисляются ферментом с одинаковой скоростью. Жирные кислоты с транс-конфигурацией двойных связей ферментом не окисляются.
Липоксигеназа широко распространена в растительном мире. Она найдена в пшенице, семенах масличных культур, бобовых, люцерне; особенно велико ее содержание в соевой муке. В результате действия этого фермента происходит прогоркание пищевых продуктов.
Конкурентными ингибиторами фермента являются транс-линолевая и 10, 12-октадекандиеновая кислоты, также (хотя и менее эффективными) ненасыщенные и мононенасыщенные жирные кислоты.
При переработке пищевых продуктов особенно важны ингибиторы липоксигеназы, которые взаимодействуют со свободными радикалами, образующимися в качестве промежуточных продуктов, при действии этого фермента на ненасыщенные жирные кислоты, обрывают цепь превращений благодаря этому прекращают процесс окисления. Таким ингибитором является широко используемый в качестве антиоксиданта токоферол – витамин Е. Фермент можно инактивировать также термической обработкой продукта.
Препараты липоксигеназы находят ограниченное применение при выпечке белого хлеба. Во время замеса теста фермент выполняет различные функции, в результате чего улучшается цвет мякиша и увеличивается объем хлеба.
Активность липоксигеназы определяют с помощью полярографического или монометрического метода по измерению поглощения кислорода.
Принцип метода основан на измерении поглощения кислорода реакционной смесью. Максимум действия липоксигеназы злаков находится при рН 7, а липоксигеназы сои – при рН 9.
Техника определения: отвешивают 2-3 г материала и растирают с фосфатным буфером (рН 6,8) в соотношении 1:5 или 1:10. Затем в основную часть сосуда Варбурга (рис. 6) приливают 2 см3 опытной пробы (гомогената), а в боковую его часть наливают 1 см3 суспензии натриевой соли линолевой кислоты, которую готовят перед употреблением. Для этого энергично встряхивают 0,20 см3 линоленовой кислоты с 5,8 см3 0,1 н. раствора КОН, 20 см3 фосфатного буфера с рН 6,3 и 34 см3 Н2О.
В 1 см3 такового субстрата содержится 3,3 мг линоленовой кислоты рН 7. Далее в центральную часть прибора приливают 0,3 см3 20 %-го раствора КОН для улавливания углекислоты. Объем жидкости в основном сосудике доводят водой до 5 см3. После этого сосуды соединяют с манометром и выдерживают на водяной бане аппарата 20 мин, до выравнивания температуры. Закрыв, верхние краны манометров и наклонив их, переливают в основную часть сосуда и затем включают качание на определенный срок. Одновременно устанавливают контрольные приборчики с манометрами, причем вместо субстрата в боковую часть сосуда наливают 1 см3 воды; в остальном поступают, так же, как и с опытным.
Показания манометров снимают через определенное число минут (5-10). Активность фермента выражают в кубических сантиметрах поглощенного кислорода на 100 мг белка или на 1 г сухой массы за условный промежуток времени.
Для вычисления объема газа, выделившегося при реакции, надо знать константу К каждого сосуда. Точную вместимость сосудов узнают по массе объема ртути (или воды), пошедшей на заполнение сосудов, и по объему манометра до нулевой точки. Зная объем 1 г ртути при определенной температуре, вычисляют исходящую вместимость сосуда. Константу К сосудов вычисляют по формуле:
,
где V1 – общая исходная вместимость реакционного сосуда и капиллярной трубки до нулевой точки, см3;
V2 – объем взятой жидкости в сосудик, см3;
Т – температура термостатной бани (если температура отрегулирована на 25 0С, то Т= 273 + 25 = 298;
а – растворимость газов (см3) в 1 см3 воды (растворимость кислорода) при 250С равна 0,028, углекислоты – 0,759;
Р0 – давление, равное 10000 мм столба жидкости Броди.
Материалы, реактивы и оборудование: линолевая кислота (удобно получить из подсолнечного масла) или масло; 20 %-й раствор КОН; фосфатный буфер с рН 6,8; аппарат Варбурга.
Описание аппарата Варбурга
Важной частью аппарата (рис. 6) является градуированная У-образная капиллярная манометрическая трубка, один конец которой открыт, а другой сообщается с воздухом посредством крана и имеет отросток, изогнутый под углом. Трубку заполняют подкрашенной жидкостью Броди (d=1,033 г(см3)-1, которую готовят растворением 4,6 г хлористого натрия и 1 г холеиновокислого натрия в 100 см3 воды с добавлением нескольких капель спиртового раствора (20 %-го) тимола. Для окраски жидкости добавляют немного кислого фуксина или флуоресцина. Давление в 1 атм. соответствует столбу жидкости Броди в 10 мм. Оба колена манометра 1 соединяются внизу в одну трубку, на которую надета каучуковая трубка 2, закрытая пробкой и имеющая приспособление для регулировки уровня жидкости Броди в обоих коленах (винтовой зажим 3). Боковой отросток правого колена манометра служит для соединения с реакционным сосудом 4, который имеет боковое ответвление 6 и впаянный в дно центральный стаканчик 5. Сосуды погружают в ванну большой вместимости, а манометры закрепляют снаружи. В ванне на протяжении всего опыта поддерживается строго определенная температура. В аппарате Варбурга постоянная температура обеспечивается ультротермостатом. Установка рабочей температуры производится при помощи контактного термометра с регулировкой по контрольному термометру.
Рисунок 6 – Манометрическая трубка аппарата Варбурга с сосудиком
(слева – вид спереди; справа – вид сбоку)
Определение йодного числа жиров
Йодное число выражается количеством граммов йода, необходимого для насыщения ненасыщенных жирных кислот, содержащихся в 100 г жира.
Йодное число является одним из наиболее важных показателей для масел (жиров). Одно позволяет судить о степени насыщенности масла (жира), о склонности его к высыханию, прогорканию и другим изменениям, происходящим при хранении и переработке пищевых и технических масел. Чем больше содержится в жире ненасыщенных жирных кислот, тем выше йодное число. Уменьшение йодного числа в процессе хранения масла является показателем его порчи.
Растительные жиры (масла), имеющие в основном жидкую консистенцию, содержат, главным образом, непредельные кислоты.
Жиры животного происхождения – в большинстве своем твердые, так как в их состав входят преимущественно триглицериды предельных жирных кислот.
Принцип метода основан на свойстве ненасыщенных жирных кислот присоединять галогены по месту двойных связей.
Взаимодействие ненасыщенных жирных кислот с йодом протекает по уравнению
I2 + 2Na2S2O3 = 2NaI + Na2S4O6
Непрореагировавший йод оттитровывают 0,1 н. раствором тиосульфата натрия.
Техника определения: сухую коническую колбу со шлифом емкостью 250 см3 взвешивают на аналитических весах, помещают туда около 0,5 г масла и снова взвешивают колбу. По разности масс определяют величину навески масла. В колбу добавляют 25 см3 этилового спирта для растворения навески. Если масло плохо растворяется, колбу нагревают на водяной бане. Во вторую колбу приливают 25 см3 спирта без жира «слепой опыт». В обе колбы (опыт и контроль) прибавляют по 12,5 см3 0,2 н. спиртового раствора йода, добавляют по 100 см3 дистиллированной воды и закрывают пробкой. Через 5 минут содержимое колб оттитровывают 0,1 н. раствором тиосульфата сначала до появления слабо-желтого окрашивания, а потом, прибавив 1 см3 раствора крахмала, титруют до исчезновения синего окрашивания.
При расчетах учитывают, что 1 см3 0,1 н. тиосульфата натрия соответствует 1 см3 0,1 н. раствора йода. Йодное число (ИЧ) вычисляют по формуле
,
где Vк – количество 0,1 н. раствора тиосульфата, пошедшее на титрование контрольного опыта, см3;
Vо – количество 0,1 н. раствора тиосульфата, пошедшее на титрование опытного образца, см3;
k – поправочный коэффициент к титру приблизительно 0,1 н. раствора тиосульфата;
0,0127 – титр раствора тиосульфата по йоду;
m – навеска масла, г.
Материалы, реактивы и оборудование: масло растительное или жир животный; смесь спирта с диэтиловым (петролейным) эфиром (1:1); 0,1 н. гидроксид калия (в 96 %-м спирте; 1 %-й раствор фенолфталеина;. 0,5 н. раствор соляной кислоты; 0,5 н. спиртовой раствор гидроксида калия; этиловый спирт; 0,2 н. раствор йода в 96%-ном спирте; 0,1 н. раствор гипосульфита; 0,5 %-й раствор крахмала; колбы конические на 50 см3 или 100 см3 и на 250 см3; цилиндры на 10-25 см3 и на 100 см3; бюретка с краном на 25 или 50 см3. Колбы конические на 50 см3 с обратным холодильником; пипетки на 1,2 см3 и 10 см3; баня водяная.