Файл: Химия и биохимия липидов_2007.doc

Принцип метода: активность триацилглицерол-липазы определяется по количеству свободных жирных кислот, образующихся в результате действия фермента на пробу жира (по разности между содержанием их в пробе после действия фермента и в исходной пробе). Свободные жирные кислоты титруют 0,1 н раствором щелочи, далее рассчитывают кислотное число пробы жира до гидролиза (контрольный опыт) и после гидролиза (основной опыт). Изменение кислотного числа жира показывает активность триацилглицерол-липазы.

Техника определения: 1 г семян клещевины (одно или два семени) очищают от оболочки, переносят в фарфоровую ступку, тщательно растирают и смешивают с 2 г подсолнечного масла (2,5 см³), добавляют 2 см³ буферной смеси с рН 4,8 и оставляют на 30 минут для гидролиза.

После этого в ступку добавляют 20 см³ смеси спирта с эфиром и несколько капель фенолфталеина. Титрование проводят 0,1н. раствором КОН до образования слабо-розовой окраски.

Контрольный опыт проводится без предварительного настаивания.

Кислотное число жира вычисляется по следующей формуле:

где V – количество см³ 0,1 н. КОН;

5,6 – количество мг КОН в 1 см³ 0,1 н. раствора КОН;

m – навеска жира, г.

Формула записи результатов.

Объем 0,1 н. раствора КОН (см³), пошедшего на титрование свободных жирных кислот в опытах (основном и контрольном).
Кислотное число жира (мг/г) в опытах (основном и контрольном)
Вывод.

Материалы, реактивы, оборудование: семена клещевины, подсолнечное масло, буфер с РН 4,8, смесь спирт-эфир (1:1), 0,1 н. КОН, фенолфталеин, ступка, бюретка.

Кинетика действия липазы

Об активности липазы судят по количеству жирных кислот, образующихся при гидролизе жира за определенный промежуток времени (за 1 минуту).

Техника определения: в 6 пробирок наливают по 1 см³ эмульсии жира, по 5 капель препарата липазы или 5 %-го раствора панкреатина и содержимое титруют 0,05 н. раствором NаОН до розового окрашивания. Остальные 5 пробирок помещают в водяную баню или термостат при температуре 37⁰С. Через каждые 10 минут вынимают по одной пробирке и титруют 0,05 н. раствором NаОН в присутствии фенолфталеина до розового окрашивания, результаты титрования записывают, затем графически изображают процесс гидролиза жира под действием липазы, откладывая на оси абсцисс время действия фермента, а на оси ординат – количество щелочи, пошедшее на титрование. Отмечают время, по истечении которого скорость действия липазы замедляется и приближается к минимальной.

Материалы, реактивы, оборудование: препарат липазы или 5 %-й раствор панкреатина, 5 %-я эмульсия жира, 0,5 %-й раствор NаОН, бюретки, водяная баня, термометр, пробирки на 25 см³ с пришлифованными пробками.

Гидролитическое расщепление жира под действием липазы

Гидролиз жира легко наблюдать под влиянием липазы поджелудочной железы. Удобным субстратом является молоко, жир который находится в эмульгированном состоянии. Активатором липазы является желчь. Степень гидролиза жира можно определить по изменению рН за счет образования свободных жирных кислот или количества этих кислот, определяемых титрованием раствором щелочи отдельных проб молока.

Материалы, реактивы и оборудование: молоко цельное охлажденное, препарат липазы, панкреатин,1 %-й спиртовой раствор фенолфталеина, 10 %-й раствор соды, термостат.

Техника определения: в 3 пробирки налить по 2-3 см³ молока предварительно прокипяченного и охлажденного. В каждую из них добавляют по одной капле фенолфталеина и по 1-2 капли 10 %-го раствора соды до розового окрашивания. В первую пробирку приливают пять капель желчи, которая является активатором липазы. В первую и вторую пробирки приливают 2 капли 5 %-го раствора панкреатина (источник липазы), в 3-ю – того же панкреатина, предварительно прокипяченного. Все пробирки ставят в термостат при температуре 37⁰С и наблюдают:

В какой пробирке окраска не изменилась? Почему?
В каких пробирках окраска изменилась? Почему?
В каких пробирках окраска изменилась быстрее и почему?

Определение числа омыления

Числом омыления называется число миллиграммов гидроксида калия, необходимое для нейтрализации свободных и омыления связанных (в форме глицеридов) жирных кислот, содержащихся в 1 г масла.

Количество КОН, которое требуется для омыления 1 г жира, зависит от молекулярной массы жирных кислот глицеридов жира. Чем больше молекулярная масса жирных кислот, входящих в состав жира, тем меньше молекул будет в 1 г жира и, следовательно, меньше КОН пойдет на омыление.

Принцип метода: основан на связывании (омылении) гидроксидом калия жирных кислот, входящих в триглицерид, и нейтрализации свободных жирных кислот.

Реакция омыления:

С₃Н₅ (ОСОR)₃ + 3КОН = С₃Н₅(ОН)₃ + RСООК

На омыление 1 молекулы жира затрачивается 3 молекулы КОН.

Количество щелочи, не связавшейся с жиром, оттитровывают соляной кислотой.

Техника определения: в одну колбу вместимостью 50 см³ вносят 0,5 г жира, отвешенного на аналитических весах, в другую – 0,5 см³ воды, затем в обе добавляют из бюретки по 15 см³ 0,5 н. спиртового раствора гидроксида калия. Колбы закрывают пробками с обратным воздушным холодильником (длиной 70 см³ ) и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30-40 минут при периодическом встряхивании. Следят, чтобы жидкость в колбе кипела слабо, а верхняя часть трубки не нагревалась.

После полного омыления глицеридов и нейтрализации свободных жирных кислот к прозрачному и однородному мыльному раствору добавляют по 15-20 см³ воды, по 3-4 капли фенолфталеина и титруют 0,5 н. раствором соляной кислоты до исчезновения розового окрашивания (определяется количество не связавшейся щелочи). Исходя из того, что 1 см³ 0,5 н. раствора КОН соответствует 28 мг его, расчет числа омыления определяется по формуле:

где: V_к и V_о – объем 0,5 н. раствора НСL, затраченного на титрование, соответственно, контроля (колба с водой) и опыта (колба с эфиром); см³; k – коэффициент поправки к титру 0,5 н. раствора НСL; m – масса жира, г

Материалы, реактивы и оборудование: спиртовой раствор гидроксида калия 0,5 н. (30 г химически чистого КОН растворяют в 1 дм³ этилового спирта при нагревании в колбе с обратным холодильником, через сутки раствор фильтруют и сохраняют в склянке из темного стекла), раствор соляной кислоты (0,5 н.), раствор фенолфталеина 1 %-й, масло, водяная баня, пробки, пробирки.

Определение кислотного числа

Кислотное число характеризует кислотность жира и измеряется количеством миллиграммов гидроксида калия, необходимого для нейтрализации свободных жирных кислот в 1 г жира.

Кислотное число, наряду с другими физико-химическими показателями, характеризует качество масла. Например, если масло получено из зерен семян, то свободных жирных кислот в нем мало, в масле же из незрелых семян содержание свободных жирных кислот значительно выше. При хранении масла наблюдается гидролиз глицеридов, который приводит к накоплению свободных жирных кислот, т.е. возрастанию кислотности. Повышение кислотности масла указывает на снижение его качества.

Принцип метода основан на том, что свободные жирные кислоты, имеющиеся в масле, оттитровываются 0,1 н. раствором КОН. Обычно титрование проводят гидроксидом калия, а не гидроксидом натрия, так как образующиеся калиевые мыла лучше растворимы в условиях опыта.

Техника определения. 2-3 г жира помещают в коническую колбу вместимостью 50-100 см³, растапливают на водяной бане с температурой 50-60 ⁰С и растворяют в 10-15 см³ нейтральной спиртоэфирной смеси.

К прозрачному раствору добавляют 3-4 капли фенолфталеина и при постоянном перемешивании по каплям титруют 0,1 н. спиртовым раствором гидроксида калия до появления слабо-розового окрашивания. Окраска после взбалтывания не должна исчезнуть в течение 0,5-1 минут.

Кислотное число определяют по формуле:

где V – количество 0,1 н. раствора КОН, израсходованное на титрование, см³; k – коэффициент поправки на титр 0,1 н. раствора КОН; 5,611 – коэффициент пересчета миллилитров 0,1 н. раствора КОН в миллиграммы (1 см³ 0,1 н. раствора КОН содержится 5,611 мг КОН); m – навеска жира, г.

Материалы, реактивы и оборудование: нейтрализованная спиртоэфирная смесь (смесь спирта и эфира в соотношении 1:1 нейтрализуют в присутствии фенолфталеина 0,1 н. спиртовым раствором КОН до слабо-розового окрашивания), Гидроксид калия 0,1 н. раствор в 96 %-м спирте, спиртовой раствор фенолфталеина 1 %-й (1 г фенолфталеина, 70 см³ спирта и 30 см³воды) масло растительное или жир животный.

Определение эфирного числа

Эфирным числом называют количество миллиграммов гидроксида калия, необходимого для нейтрализации освобождающихся при омылении эфирных связей жирных кислот в 1 г масла. Оно характеризует содержание связанных в виде эфиров жирных кислот в масле.

Экспериментальное эфирное число (ЭЧ) определяют по разности между числом омыления и кислотным числом.

Окислительное прогоркание жиров

Наиболее распространенным видом порчи жиров в процессе хранения является окислительное прогоркание, при котором происходит накопление продуктов окисления, снижение пищевой ценности и ухудшение органолептических показателей.

Процесс окисления может проходить неферментативным (химическим) и ферментативным (биохимическим) путем.

Жиры и масла, особенно содержащие остатки ненасыщенных (арахидоновой, линоленовой, линолевой, олеиновой) жирных кислот, окисляются кислородом воздуха. В результате неферментативного окисления кислород присоединяется к ненасыщенным жирным кислотам по месту двойных связей с образованием циклической перекиси. При биохимическом окислении этот процесс катализируется ферментом липоксигеназой с образованием гидроперекиси. Так же при окислительном прогоркании идут цепные радикальные процессы, в которых участвует кислород и ненасыщенные жирные кислоты, образуя перекиси и гидроперекиси. Пероксиды и гидропероксиды являются первичными продуктами окисления. В результате дальнейших сложных превращений этих соединений образуются вторичные продукты окисления: спирты, альдегиды, кетоны, эпоксисоединения, кислоты с углеродной цепочкой меньшей длины, эфиры, оксикислоты, кетоэфиры и т.д.

Именно вторичные продукты окисления, особенно карбонилсодержащие вещества, вызывают появление неприятного вкуса и запаха жира, изменение его цвета (прогоркание). Образующиеся продукты могут менять физические свойства жира, приводить к вспениванию фритюрных масел, способствовать распаду витаминов, оказывать токсическое воздействие на организм человека.

На окисление жиров влияют: природа жирных кислот, входящих в состав жира. Чем выше непредельность остатков жирных кислот, тем больше скорость его окисления. Кислоты по способности к окислению неферментативным путем можно расположить в следующий ряд: