Файл: Ферменты. Гидролазы_2000.doc

Молокосвертывающие препараты, помимо молокосвертывающей активности, обладают и протеолитической активностью, т.е. способностью расщеплять белки молока.

В связи с острым дефицитом в сыродельной промышленности натурального химозина (сычужный фермент) все большее применение находят его заменители микробного и животного происхождения. Однако не все препараты могут успешно заменять сычужный фермент. Препараты, имеющие высокую протеолитическую активность, вызывают глубокий гидролиз казеина, что приводит к резкому снижению качества сыра (появлению горечи). В связи с этим при определении пригодности какого–либо препарата в качестве заменителя сычужного фермента необходимо исследовать его протеолитическую активность.

Особенностью действия указанного препарата на казеиновую молекулу является избирательная атака им связи фенилаланил–метионин к–казеина, что в свою очередь приводит к открытию остатков фосфорной кислоты и объединению молекул параказеина в сгусток посредством образования Са-мостиков. Схематично это можно выразить следующим образом (рисунок 7):

Далее молекула казеина практически не гидролизуется, что обеспечивает стойкость сгустка и, далее, сырного зерна. Графически это изображено на рисунке 8.

В данном случае подъем кривой в течении 15 минут (кривая 1) отражает образование ГМП. В дальнейшем гидролиз практически отсутствует. Отклонение от этого (кривая 2) как правило приводит к нарушениям в образовании сгустка и созревания сыров. Расстояние между кривыми 1 и 2 называется мерой неспецифичного протеолиза (МНП). Чем больше эта величина, тем выше опасность появления горького, нечистого и других привкусов в готовом продукте.

Рисунок 7 – Схема действия сычужного фермента на молекулу казеина

Рисунок 8 – График зависимости образования продуктов гидролиза казеина от времени реакции

В данной работе ставится задача определить пригодность испытуемого препарата в качестве заменителя сычужного фермента исходя из интенсивности гидролиза казеина во времени.

Принцип метода.Определение активности сычужного фермента и его заменителей микробного и животного происхождения основано на учете накопления продуктов гидролиза казеина, растворимых в 1,125 М трихлоруксусной кислоте через определенный промежуток времени от начала реакции.

Ход работы. В пробирки отбирают по 2 мл приготовленного казеинового субстрата и термостатируют 5 мин. при температуре 35 С. Затем вносят по 0,5 мл раствора ферментного препарата с одновременной фиксацией времени. Реакцию прекращают через 5, 10, 15, 20, 30, 40, 90 минут путем добавления 5 мл 1,125 М раствора ТХУ. Полученную смесь перемешивают и оставляют на 30минут, после чего ее фильтруют через двойной складчатый фильтр. Параллельно с указанным определением ставятся нулевая и холостая пробы.

Для нулевого значения в пробирку отбирают 2 мл раствора субстрата, 5 мл 1,125 М раствора ТХУ и 0,5 мл раствора ферментного препарата.

Результат холостого опыта исключает экстинцию реактивов. Для этого к 5 мл 1.125 М раствора ТХУ добавляют 2,5 мл дистиллированной воды и фильтруют так же, как и в случае нулевого опыта через 30 минут. В фильтрате определяют продукты гидролиза казеина, растворимые в 0,75 М растворе ТХУ. Определенное количество фильтрата (не более 1 мл) отбирают в пробирки с таким расчетом, чтобы концентрация полученных продуктов распада казеина во время колориметрирования находилась в пределах от 20 до 150, нейтрализуют равным количеством 0,75 М раствора NaOH ( с целью обеспечения необходимого значения рН для реакции с медным и фенольным реагентами), добавляют дистиллированную воду до объема 2 мл, а затем все необходимые реактивы, предусмотренные методом Лоури. После 45–минутной экспозиции замеряют экстинцию при 750 нм по отношению к значению холостого опыта.

Для построения калибровочной кривой (20 – 200) служит казеин по Гамммарстену (см. Методические указания к выполнению УИРС по биохимии для студентов спец. 1017, работу № 5 "Определение белка в молоке по методу Лоури"). Предполагается, что продукты распада казеина дают те же экстинции, что и неизменный казеин.

Опыт проделывают трижды.

Расчет полученных данных

Протеолитическая активность показыват, какое количество мг белка казеина переводится в растворимую форму одним миллиграммом ферментного препарата при 35 С, рН 6,6, за определенный промежуток времени. Расчет протеолитической активности (Е_р) производится по следующей формуле:

(16)

где: Е_р – протеолитическая активность ферментного препарата;

С – концентрация ферментного препарата, мг;

А – количество растворимых продуктов гидролиза казеина за определенный промежуток времени, мг

, (17)????

где: В – количество продуктов гидролиза казеина в соответствующе измеренной экстинкции;

7,5 – объем пробы (2 мл субстрата, 0,5 мл ферментного препарата, 5 мл раствора ТХУ);

V – количество раствора, взятого для колориметрирования, мл.

Материалы и реактивы.Казеин (см. Приложение 1, п.7); реактив А, В, С (см. Приложение 1, п.17); реактив Фолина (см. Приложение 1, п. 8); ферментные препараты; 1,125 М раствор ТХУ; 0,75 М раствор едкого натра.

Оборудование.Складчатый фильтр; пробирки; пипетки на 1 и 2 мл с ценой деления 0,05 мл; ФЭК–60 или ФЭК–56М.

Эстеразы

Липаза или триацилглицероллипаза катализирует расщепление жиров (три- ацилглицеринов) на глицерин и жирные кислоты. Реакция идет по схеме:

По существующей классификации ферментов липаза принадлежит к классу гидролаз и подклассу эстераз, действующих на сложноэфирные связи.

Как и в случае других гидролаз, радикал гис активного центра фермента служит для переноса протонов, радикал сер – для акцептирования ацильной группы, высвобождающейся в момент распада сложноэфирной связи в молекуле триглицерида. Радикал изолейцина взаимодействуют с углеводородным радикалом остатка высшей жирной кислоты и способствует закреплению молекулы триглицерида в активном центре фермента (см. рисунок 7).

Рисунок 9–Механизм действия триацилглицероллипазы

Скорость расщепления зависит от длины цепи жирных кислот. Скорость реакции уменьшается в ряду: три–, ди–, и моноглицериды.

Источником для получения промышленных препаратов липазы являются поджелудочная железа, семена клещевины.

Активаторами липазы служат соли желчных кислот. Активирующий эффект основан на эмульгирующем действии.

рН–оптимум активности (и стабильности) у разных ферментных препаратов различен и зависит от источника фермента. Так, панкреатическая липаза имеет оптимум активности при рН = 8, липаза молока – при рН = 9, липаза из клещевины – при рН = 4,3, микробные липазы – при рН = 5–6. Из перечисленных липаз наиболее термостабильной является липаза молока.

Липазам принадлежит важная роль в технологии продуктов питания. В молоке слабая липазная активность способствует образованию аромати-зирующих веществ; липаза пшеницы и других злаковых культур способствуют порче муки. Наконец, микробные препараты липазы используются для гидролиза жира в тех случаях, когда необходимо омыление при сохранении биологически активных жирорастворимых веществ (например, токоферола).

Гидролитическое расщепление жира под действием липазы

Принцип метода.Гидролиз жира хорошо наблюдается под влиянием липазы поджелудочной железы. Удобным субстратом является молоко, жир которого находится в эмульгированном состоянии. Активаторами липазы является желчь. Степень гидролиза жира можно определить по изменению рН за счет образования свободных жирных кислот и количеству этих кислот, определяемых титрованием раствором щелочи отдельных проб молока.

Ход работы. В 3 пробирки налить по 2–3 мл молока, предварительно прокипяченного и охлажденного. В каждую из них добавляют по одной капле фенолфталеина и по 1 –2 капли 10 %–ного раствора соды до розового окрашивания. В первую пробирку приливают 5 капель желчи, которая является активатором липазы. В 1–ю 2–ю пробирку приливают 2 капли 5 %–ного раствора панкреатина (источник липазы), в 3–ю – того же панкреатина, но предварительно прокипяченного. Все пробирки ставят в термостат при 37 С и наблюдают: