ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 30.06.2025
Просмотров: 375
Скачиваний: 6
Определение активности протеолитических ферментов
Определение суммарной активности
Отдельные группы протеолитических ферментов проявляют максимальную активность при различной кислотности среды, поэтому их активность следует определять при различных значениях рН. Ниже приведен один из распространенных способов определения суммарной активности протеолитических ферментов, в основу которого положен метод Ансона.
Принцип метода.Ферментным препаратом, выделенным из растительного материала, действуют на раствор стандартного белка (казеина или гемоглобина), затем неразложившийся белок осаждают, а в фильтрате определяют количество разложившегося белка по колориметрической реакции Фолина или на спектрофотометре. Принимается, что количество разложившегося белка пропорционально содержанию в растворе тирозина. Рассчитывают протеолитическую активность ферментного препарата на 1 мг белка или на 1 г навески за 1 ч.
Ход работы.Навеску взвешивают на аналитических весах: при анализе свежего растительного материала 5 г, а семян – 2 г. Свежий растительный материал растирают в ступке с жидким азотом, а сухой – с песком и переносят в коническую колбу. Ступку смывают водой. Общий объем воды, добавляемой к навеске, должен быть 50 мл. После этого суспензию настаивают в течение 1 ч в холодильнике при периодическом помешивании. После настаивания суспензию фильтруют в сухой стакан или колбу через складчатый фильтр или осадок отделяют центрифугированием в течение 10–15 мин при 5–6 тыс. об/мин. В качестве ферментного препарата используют фильтрат или надосадочную жидкость.
При определении активности протеолитических ферментов в 2 пробирки приливают по 2 мл ферментного препарата. В одну из пробирок (контрольную) прибавляют 4 мл 14%–ного раствора трихлоруксусной кислоты для инактивации фермента. Затем в пробирки добавляют по 2 мл субстрата (1%–ного раствора казеина или 1%–ного гемоглобина) и тщательно перемешивают. Пробирки инкубируют на водяной бане при 30 С точно 30 мин. За это время под действием протеолитических ферментов частично гидролизуется внесенные в опытную пробирку казеин или гемоглобин.
Через 30 мин в опытную пробирку для прекращения действия ферментов добавляют 4 мл 14 %–ного раствора трихлоруксусной кислоты. После этого содержание пробирок фильтруют через плотный фильтр (фильтрат должен быть совершенно прозрачным) и в фильтрате определяют количество тирозина, образовавшегося в результате расщепления белков под действием протеолитических ферментов.
Количество тирозина определяют по реакции с реактивом Фолина. Для этого к 0,5 мл фильтрата из каждой пробирки добавляют по 0,5 мл 0,0025 М раствора СuSО4, по 4 мл 0,5 н. раствора NаОН и по 1,5 мл разбавленного в 3 раза реактива Фолина. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и через 20–30 мин после стабилизации окраски определяют оптическую плотность на спектрофотометре при 760 нм или фотоэлектроколориметре с красным светофильтром.
Вычисление результатов. При спектрофотометрических определениях вычисляют разность D0–Dк, где D0– оптическая плотность опытного образца, Dк – оптическая плотность контрольного образца. Протеолитическую активность препарата выражают в единицах протеолитической активности на 1 мг белка, содержащегося в ферментном препарате (для этого необходимо определить содержание белка в нем), или на 1 г навески растительного материала за 1 ч.
Пример расчета.Допустим, что оптическая плотность опытного образца 0.400, а контрольного 0,240, т. е. разность составляет 0,160. Навеска материала 2 г. Разбавление 50 мл. Для анализа взято 2 мл ферментного препарата, что соответствует навеске 0,08 г. Для пересчета протеолитической активности на 1 г необходимо 0,160 разделить на 0,08, что дает 2,00 за 30 мин, а для перевода на 1 ч результат умножают на 2. Таким образом, условная протеолитическая активность исходного материала составляет 4,00 единицы.
Общая формула для расчета:
, (14)
где Ер – протеолитическая активность (в условных единицах);
D0 – оптическая плотность опытного раствора после окрашивания ;
Dк – оптическая плотность контрольного раствора после окрашивания ;
2 – коэффициент для пересчета на 1 г;
50 – общий объем вытяжки, мл;
m – навеска растительного материала, г;
V – объем вытяжки ферментного препарата, взятый для анализа, мл.
Материалы и реактивы. 1 %–ный раствор казеина (см. Приложение 1, п.19); 1 %–ный раствор гемоглобина (см. Приложение 1, п. 20); жидкий азот; реактив Фолина (см. Приложение 1, п. 8); 0,5 и 1 н. NаОН; 1 н. и 0,3 н. НСl; 14 %–ная трихлоруксусная кислота; 0,0025 М раствор СиSO4; 0,5 М раствор Na2CO3; 1/5 М фосфатный буфер рН 8,0 (см. Приложение 1, п.6).
Оборудование. Спектрофотометр; ступка фарфоровая; центрифуга; холодильник; водяная баня; колбы мерные на 50 и 100 мл; конические колбы на 100 мл; воронки; градуированные пипетки; пробирки.
Определение протеолитической способности (пс)
Важным этапом технологии многих пищевых производств являются биохимические превращения белков, происходящие под действием протеолитических ферментов.
В основе определения протеолитической активности лежат различные принципы: изменение физико–химических свойств субстратов, определение убыли субстрата, учет количества продуктов протеолиза.
Контроль по убыли субстрата в основном позволяет судить об активности протеиназ, так как при этом определяется количество непрогидролизованного белка. Поэтому метод можно использовать для характеристики протеолитических препаратов, применяемых в различных отраслях промышленности.
Принцип метода. Заключается в гидролизе казеина известным количеством ферментного препарата и определении степени расщепления белка по уменьшению количества соляной кислоты, связываемой оставшимся непрогидролизованным казеином. После ферментного воздействия в течение 1 ч в опыте и перед добавлением такого же количества ферментной вытяжки в контроле ферментативную реакцию прерывают 0,1 н. раствором соляной кислоты. Казеин, оставшийся нерасщепленным, количественно осаждается сульфатом натрия. Выпадая в осадок, казеин увлекает в связанном состоянии соответствующее количество соляной кислоты. Осадки профильтровывают, а 10 мл фильтрата титруют 0,1 н. раствором NаОН. Количество NаОН, израсходованное на титрование в опыте и контроле, принимается за меру протеолитической активности анализируемого объекта.
Этот метод достаточно прост и удобен в работе. За единицу активности принято количество фермента, которое за 1 ч при 30 С катализирует гидролиз 1 г казеина.
Ход работы. В колбочки (плоскодонные или конические) на 100 мл набирают пипеткой по 20 мл раствора казеина и помещают на водяную баню с температурой 30 С. Через 10 мин в них наливают при перемешивании 10 мл ферментного раствора. Общий объем (казеин и ферментный раствор) должен быть равен 30 мл, так что, если на анализ берется меньше 10 мл ферментного раствора, недостающий до 30 мл объем пополняется дистиллированной водой, которую приливают непосредственно перед введением фермента. Ровно через час в колбу приливают (тоже при перемешивании) пипеткой 20 мл 0,1 н. раствора НCl в 7,5 % Nа2SО4 (раствор второй) и немедленно фильтруют до полной прозрачности (возвращая фильтрат на тот же самый фильтр). Контроли (два параллельных определения) ставят таким же образом, только до введения ферментного раствора прибавляют смесь НCl с 7,5 % Nа2SО4 и колбы не выдерживают на водяной бане, а раствор сразу фильтруют. В 20 мл фильтрата контроля и опыта оттитровывают 0,1 н. раствором NаОН избыток НСl. Титрование ведут в присутствии двух капель 0,5 %–ного спиртового раствора крезолрота до красного окрашивания. Разность титрований (опыт–контроль) в пересчете на 10 мл фильтрата может составить 0,4–2,5 мл. Если она менее 0,4 или более 2,50 мл, анализ повторяют с большей или меньшей дозировкой фермента, меняя количество вводимого ферментного раствора или его разведение.
Расчет активности. По разности титрования опыта и контроля в миллилитрах 0,1 н. NаОН в перерасчете на 10 мл фильтрата находят единицы активности (см. Приложение 2, табл. 2). В табл. 2 (см. Приложение 2) приведены также значения протеолитической способности при условии, что на анализ введено 10 мл ферментного раствора в разведении 1:100 или 1:50.
Для других количество введенного раствора или других разведений пересчет
ПС производят по следующей формуле:
, (15)
где Ер – протеолитическая способность;
е – количество единиц, найденное по таблице 2 (см. Приложение 2) в соответствии с результатами титрования;
m– навеска препарата, соответствующая 20 мл фильтрата (1/5 общего количества, взятого на анализ), г.
Пример расчета. 1. Для анализа брали 10 мл ферментной вытяжки 1:50. На титрование опыта пошло 4,2 мл 0,1 н. раствора NаОН, на титрование контроля – 2,0 мл. Разность титрования в пересчете на 10 мл фильтрата /4,2–2,0/:2 = 1,1 мл 0,1 н. раствора NаОН. Величина 1,1 соответствует по таблице Ер = 1,868.
2. Для анализа брали 5 мл раствора очищенного препарата 1:1000. Разность титрований опыта и контроля равна 1,8 мл 0,1 н. раствора NаОН. Величина 1,8 соответствует по таблице 2 (см. Приложение 2), 0,1353 ед. вычисляем " Ер".
В 5 мл раствора 1:1000 содержится 0,005 г фермента. Эти 0,005 г находятся в 50 мл реакционной смеси, а в 10 мл фермента 0,001 г.
Полученные величины активности округляют: для культур и сиропов до 0,01, а для очищенных препаратов – 0,1.
Материалы и реактивы. 1. 5 %–ный щелочной раствор казеина (см. Приложение 1, п.13); 0,1 н. раствор НСI в 7,5 %–ном растворе Nа2SО4; 0,1 н. раствор NаОН; индикатор – 0,5 %–ный спиртовой раствор крезолрота; раствор фермента (см. Приложение 1, п.14).