Файл: 696.pdf

Наибольшую концентрацию биомассы, достигаемую в стационарной фазе роста, называют выходом или урожаем ( XK ). Урожай зависит от природы и количества используемых питательных веществ, а также от условий культивирования. Для биотехнолога важно определить время окончания культивирования. Оно зависит от природы и механизма образования целевого продукта. Если целевыми продуктами являются собственно биомасса продуцента, внутриклеточные продукты или внеклеточные продукты, образующиеся параллельно ( актериям) с ростом клеток, наивыгоднейшим (без учета технико-экономических показателей) временем окончания является время, соответствующее максимуму средней

продуктивности по биомассе ( PСР ), приходящееся на

время окончания экспоненциальной фазы и резкого замедления роста. Средняя продуктивность биотехнологического процесса – количество целевого продукта, полученного с единицы объема культуральной жидкости в единицу времени (формула 4).

Внекоторых случаях при получении вторичных метаболитов, например антибиотиков, образование целевого продукта начинается по окончании роста клеток и достижения стационарной фазы. В этом случае оптимальное время окончания процесса увеличивается и определяется динамикой продуктивности по конкретному продукту, не связанной с продуктивностью по биомассе. Причем выход целевого продукта пропорционален накоплению биомассы.

Взадачи биотехнологии во всех вариантах входит решение следующих основных проблем – сокращения непродуктивной лаг-фазы и продления экспоненциальной

30

В частицы фага можно упаковать 37-52 т.п.н. Учитывая размер «плеч» 15 т.п.н., размер вставки около 15 т.п.н. (Рис.19). Схема клонирования ДНК с использованием фага представлена на Рис.20.

Рис.20. Схема клонирования ДНК с использованием фага в качестве вектора.

63

другому антибиотику. Таким образом, вектор дает возможность детектировать только те клоны бактерий, которые содержат рекомбинантную плазмиду.

Таким образом, требования, предъявляемые к векторам, включают: 1. Способность реплицироваться в клетке-хозяина; 2. Способность включать чужеродные ДНК различной молекулярной массы без нарушения способности к репликации; 3. Легкость введения в клеткухозяина; 4. Наличие генетического маркера селекции, обеспечивающего быструю селекцию клеток, содержащих вектор; 5. Наличие только 1 сайта рестрикции для каждой рестриктазы.

Бактериофаг в качестве вектора

С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 т.п.н. Для клонирования более крупных фрагментов были разработаны векторы на основе бактериофага . Этот фаг является умеренным фагом E.coli К-12, содержащим двухцепочечную ДНК размером 48500 п.н. с одноцепочечными 5’-«хвостами» из 12 нуклеотидов. Их называют липкими (cos) концами.

Примерно у 30% фаговых частиц ДНК интегрируется с бактериальной хромосомой и реплицируется вместе с ней (состояние

лизогении, см. раздел 3.2).

За способность к лизогении отвечает фрагмент около 20 т.п.н. Если этот фрагмент заменить фрагментом другой ДНК (кодирующей целевой белок), образующаяся рекомбинантная молекула будет реплицироваться в клетке как ДНК «рекомбинантного» фага , вставшего на литический путь развития.

Рис.19. Строение бактериофага

62

фазы. Сокращению лаг-фазы способствует идентичность состава питательной среды инокулята и промышленного процесса, а главное – объем инокулята должен составлять 10-15% объема промышленного культивирования.

Проблема продления экспоненциальной, самой продуктивной, фазы роста является и самой трудной. Здесь важно не допустить исчерпания питательных веществ и своевременно удалять ингибирующие рост продукты метаболизма.

3.3.4. Бактерии как продуценты в биотехнологии

Бактерии являются важнейшими продуцентами в биотехнологии. С помощью бактерий получают вино, молочные продукты, закваски и другие пищевые продукты, ацетон и бутанол, этанол, уксусную и лимонную кислоты, витамины, ряд ферментов, антибиотики и каротиноиды. Бактерии участвуют в трансформации стероидных гормонов. Их используют для получения белка и ряда аминокислот. Применение бактерий для переработки отходов в биогаз или этанол даёт возможность создания принципиально новых возобновляемых энергетических ресурсов. Бактерии используют для извлечения металлов (в т.ч. золота), увеличения нефтеотдачи пластов. Благодаря бактериям и плазмидам стало возможным развитие генетической инженерии. Изучение бактерий сыграло огромную роль в становлении многих направлений биологии, в медицине, агрономии и др. Велико их значение в развитии генетики, т.к. они стали классическом объектом для изучения природы генов и механизмов их действия. С бактериями связано установление путей метаболизма различных соединений и др.

Потенциал бактерий в практическом отношении неисчерпаем. Углубление знаний об их жизнедеятельности открывает новые направления эффективного использования бактерий в биотехнологии и других отраслях промышленности.

31

Производственные штаммы микроорганизмов должны соответствовать определенным требованиям: способность к росту на дешевых питательных средах, высокая скорость роста и образования целевого продукта, минимальное образование побочных продуктов, стабильность продуцента в отношении производственных свойств, безвредность продуцента и целевого продукта для человека и окружающей среды. В связи с этим все микроорганизмы, используемые в промышленности проходят длительные испытания на безвредность для людей, животных и окружающей среды. Важным свойством продуцента является устойчивость к инфекции, что важно для поддержания стерильности, и фагоустойчивость – устойчивость к заражению бактериофагами. Примеры использования бактерий в биотехнологии приведены в Табл.2.

Таблица 2 Бактерии – продуценты важнейших биотехнологических

продуктов

последовательностей, и сигнал начала репликации, обеспечивающий репликацию исключительно в Е.coli. Плазмидный вектор pBR322 в 80-е годы был одним из самых популярных универсальных векторов. Обычно обозначение плазмидного вектора включает строчную букву «р» (от англ, plasmid) и еще несколько букв, имеющих отношение к описанию вектора или к истории его создания. Так, буквы BR в обозначении плазмиды pBR322 указывают на авторство Ф. Боливара и Р. Родригеса, сконструировавших эту плазмиду, а число 322

— цифровое обозначение, взятое из их исследовательских протоколов. Длина плазмиды pBR322 — 41 т.п.н.

Рис.18. Генетическая карта плазмиды pBR322.

Если фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из генов устойчивости, то последний инактивируется. Следовательно, успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из этих генов легко детектировать по исчезновению у бактерий устойчивости к данному антибиотику. Но при этом сохраняется устойчивость к

61

соединении липких концов. ДНК-лигаза сшивает и тупые концы.

3.Векторы для экспрессии и клонирования.

Вкачестве векторов, способных переносить в клетку-реципиент генетическую информацию, чаще используют плазмиды и бактериофаги.

Плазмидные векторы

Внехромосомные двуспиральные малые молекулы ДНК, длиной в 1-200 тысяч пар нуклеотидов автономно размножающиеся в клетке, называются плазмидами. Плазмиды, как правило, присутствуют у бактерий и являются кольцевыми молекулами, хотя у некоторых растений и грибов известны линейные плазмиды. Плазмиды выполняют разнообразные функции. Одни из них содержат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (F- плазмиды), другие несут гены устойчивости к антибиотикам (R-плазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию необычных метаболитов (плазмиды деградации). Есть плазмиды, в которых не обнаружены гены, выполняющие какие-то определенные функции (криптические плазмиды; от англ, cryptic - скрытый, латентный). Размеры плазмид варьируют от менее 1 до более 500 т.п.н. Каждая из них содержит сайт начала репликации ORI, без которого репликация плазмиды в клетке-хозяине была бы невозможна.

На Рис. представлена генетическая карта плазмиды рВR322. Это одна из наиболее часто употребляемых плазмид для клонирования. pBR322 создана на основе плазмид природного происхождения, выделенных из E. coli. Эта плазмида несет гены устойчивости к двум антибиотикам: ампициллину (ген bla) и тетрациклину (ген tet), а также уникальные сайты для BamHI, Hind III и SalI в генеТеtг, один PstI-сайт в гене Атрг, один сайт для EcoRI, находящийся за пределами кодирующих

60