Видовая идентификация стрептококков основана на их биохимической активности и может быть проведена при использовании тест-системы API 20 Strept (BioMerioux).

Видовая идентификация грамотрицательных неспорообразующих факультативно-анаэробных бактерий производится при помощи тест систем API 20E (BioMerioux). Оксидазопозитивные бактерии (Pseudomonas spp., Aeromonas spp. и др.) идентифицируются с помощью тест системы API 20NE (BioMerioux). Для идентификации лактозопозитивных бактерий могут быть использованы тест-системы Enterofermtub, а лактозонегативных Oxifermtub (BioMerioux, Becton Dickinson). Кроме того, для идентификации всех грамотрицательных бактерий может быть использована тест-система BBL CRYSTAL (Becton Dickinson) или полуавтоматическая система "Sceptor" (Becton Dickinson) с использованием полистироловых планшетов для видовой идентификации грамотрицательных факультативно-анаэробных бактерий.

При отсутствии вышеперечисленных тест-систем энтеробактерии могут быть идентифицированы с помощю 12 биохимических тестов, которые выявляют:
- способность энтеробактерий ферментировать глюкозу, лактозу, мальтозу,
- маннит, сахарозу;
- способность расти на цитратном агаре Симмонса;
- отношение к мочевине и молонату натрия;
- подвижность и способность продуцировать сероводород и индол.

Для видовой идентификации C.albicans, обладающей способностью продуцировать характерные для них хламидоспоры, подозрительные колонии (белые или розовые) пересевают со среды Сабуро на среду PCB (Diagnostics Pasteur) методом укола в толщу среды. Пробирки с пересевами инкубируют при комнатной температуре 24-48 часов. После инкубации определяют небольшой участок в зоне роста микроорганизмов и делают разветвленный мазок между двумя стеклами. Мазки изучают с помощью темнопольной микроскопии, при этом хламидоспоры ищут в зонах образования филаментов с находящимися на них бластоспорами. В случае отсутствия хламидоспор проводят повторный пересев. Если при этом вновь получают отрицательный результат, проводят биохимическую идентификацию дрожжеподобных грибов при помощи
системы API 20C Aux (BioMerioux) или Micotube (BioMerioux, Becton Dickinson). Также видовая идентификация грибов рода Candida может быть проведена с помощью микробиологической системы Quantum (Abbot).

При идентификации гарднереллы учитывается морфология колоний на селективной питательной среде через 2-4 дня инкубации. Обычно колонии бывают выпуклыми, шарообразными с гемолизом. При микроскопии – мелкие палочки или коккобациллы, по отношению к окраске по Граму – грамвариабильные. Каталазо- и оксидазоотрицательные, продуцируют кислоту при гидролизе крахмала и мальтозы, чувствительны к метронидазолу и триметоприму.

Ориентировочная идентификация лактобактерий проводится микроскопическим методом (окраска мазка по Граму), которая позволяет оценить морфологию клеток. В мазках лактобактерии имеют вид прямых палочек, расположенных в виде блоков, не имеют спор. Бактерии рода Lactobacillus не образуют каталазы и оксидазы.

---

Идентификация факультативно-анаэробных лактобактерий проводится с помощью систем индикаторных бумажных для идентификации лактобактерий (СИБ-Л) и планшета биохимического, дифференцирующего лактобактерии (ПБДЛ) (НИИЭМ, г. Нижний Новгород). Идентификации подвергаются грамположительные каталазоотрицательные палочки, выросшие через 48 часов на среде MRS. Для выделения чистой культуры проводится двукратное пассирование отдельных колоний. Дифференциация основана на выявлении ферментативных свойств штаммов по их действию на углеводы и многоатомные спирты (глюкоза, меллибоза, манноза, мелецитоза, рамноза, салицин). Учет результатов проводится через 72 часа инкубации при температуре +37⁰С. Интерпритация результатов биохимического тестирования производится при
помощи таблиц биохимических свойств лактобактерий.

Анаэробные штаммы лактобактерий идентифицируются с помощью полуавтоматической системы "Sceptor" (Becton Dickinson), после предварительного исключения способности тестируемых бактерий к спорообразованию.

Ориентировочная идентификация облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий проводится по следующим критериям: рост в присутствии желчи (диски 5 мг, BioMerioux), бриллиантового зеленого (диски 100 мкг, BioMerioux) и канамицина (диски 1000 мкг, BBL, Becton Dickinson), ферментация глюкозы, наличие черного пигмента.

Используя эти тесты, бактерии делят на 4 группы:

1 группа - Bacteroides группы fragilis. Все бактерии этой группы сбраживают глюкозу и способны расти в присутствии желчи и канамицина, бриллилантовый зеленый подавляет их рост;

2 группа – бактерии рода Prevotella. Бактерии этой группы растут в присутствии канамицина, но не растут в присутствии желчи и бриллиантового зеленого, обладают сахаролитической активностью – сбраживают глюкозу. Некоторые виды могут образовывать черный пигмент на кровяных средах после 5-7 дней инкубации;

3 группа – род Porphyromonas. Асахоролитические бактерии, не растущие в присутствии желчи и
бриллиантового зеленого, но растущие в присутствии канамицина, образуют черный пигмент. Бактерии этой группы чувствительны еще и к ванкомицину (диски 5 мкг, BBL, Becton Dickinson).

4 группа – бактерии рода Fusobacterium. Эти бактерии не растут в присутствии желчи и канамицина, но растут в присутствии бриллиантового зеленого.

Для выявления группы Prevotella melaninogenica/ Porphyromonas asacharolytica и некоторых других строгих анаэробов (Fusobacterium spp., Clostridium dificile) первичные посевы возможно исследовать в лучах длинноволнового ультрафиолетового излучения, при использовании люминисцентного микроскопа с фильтрами ФС 1-2 и СЗС 24-4. При наличии микроорганизмов группы Pr.melaninogenica / P.asacharoliticus колонии светятся малиновым цветом.
Зеленое свечение характерно для Fusobacterium spp. или Clоstridium dificile.

Финальная идентификация облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий проводится с применением биохимической идентификационной системы для этих бактерий API (BioMerioux), а также на полуавтоматической системе "Sceptor" (Becton Dickinson) c использованием полистироловых планшетов для грамотрицательных облигатно-анаэробных бактерий.

---

Грамположительные анаэробные кокки могут быть идентифицированы на основании их чувствительности к новобиоцину (диски 25 мкг) и по их биохимическому профилю с применением биохимической идентификационной системы rapid ID32 A (API – BioMerioux) или полуавтоматической системы "Sceptor" (Becton Dickinson) с использованием полистироловых планшетов для видовой идентификации грамположительных анаэробных кокков.

Ориентировочная идентификация бифидобактерий проводится микроскопическим методом (окраска мазка по Граму), который позволяет оценить морфологию клеток. В мазках бифидобактерии обычно имеют вид прямых или разветвленных палочек X,Y и V-образной формы с утолщениями на концах. Бактерии рода Bifidobacterium синтезируют фермент фруктозо-6-фосфатфосфокетолазу (Ф6-ФФК), не образуют индол и каталазу, не восстанавливают нитраты, не сбраживают адонит (рубит), дульцит, эритрит, глицерин, рамнозу и альфа-метил-D-маннозид.

Биохимическая идентификация клостридий может быть осуществлена при помощи идентификационных систем API 20A или RapID Ana II (BioMerioux).

Видовая идентификация гарднерелл проводится по морфологическим критериям (окраска по Граму – грамвариабильные коккопалочки) и на основании биохимической идентификации при помощи идентификационных систем API 20 Strep или API Zym (BioMerioux).

Ввиду отсутствия единых представлений о показателях нормы из-за, прежде всего, технической сложности культивирования облигатно-анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов в настоящее время не определены четкие критерии нормоценоза вагинальной микрофлоры, пограничных состояний и БВ. Чаще всего при бактериологической диагностике вагинального отделяемого используются следующие критерии:

Нормоценоз
- общее количество микроорганизмов в вагинальном отделяемом составляет 10⁶-10⁸ КОЕ/мл;
- абсолютное преобладание лактобактерий;
- условно-патогенные микроорганизмы в низком титре - <10⁴ КОЕ/мл;

Бактериальный вагиноз
- массивное микробное обсеменение вагинального отделяемого с общим количеством микроорганизмов, превышающим 10⁹ КОЕ/мл;
- отсутствие лактобактерий или резкое снижение их титра до 10⁴ КОЕ/мл и менее;
- полимикробный характер микрофлоры с абсолютным преобладанием облигатно-анаэробных микроорганизмов и G.vaginalis [17].
При проведении классического бактериологического исследования необходимо учитывать тот факт, что само по себе обнаружение отдельных видов облигатных анаэробов и G.vaginalis не всегда равнозначно микробиологическому диагнозу БВ, т.к. G.vaginalis и облигатно-анаэробные микроорганизмы могут быть частью индигенной микрофлоры. Поэтому, бактериологическая диагностика БВ должна, в первую очередь, основываться на интегральной оценке микрофлоры с
учетом не только ее видового и количественного состава, но и количественного соотношения отдельных ее компонентов.

---

РЕЦЕПТЫ ОСНОВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

1. Мясная вода
Парную говядину или конину освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку. 1 кг полученного мясного фарша заливают 2 л водопроводной воды и кипятят в течении часа, накипь снимают. После кипячения мясную воду остужают для застывания жира, который легко при этом удаляется, фильтруют через ватно-марлевый фильтр до полной прозрачности, затем доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают в бутыли и стерилизуют 20 минут при температуре +120⁰С.

2. Пептонная вода
К 1л дистиллированной воды прибавляют 1- 2г пептона и 0,5г хлорида натрия, устанавливают необходимое значение рН,кипятят 30 минут, проверяют рН, фильтруют через бумажный фильтр до полной прозрачности и стерилизуют при температуре +120⁰С в течение 30 минут.

3. Мясо-пептонный бульон
К 1 л мясной воды добавляют 1г сухого пептона и 5мг хлорида натрия, устанавливают нейтральную рН, кипятят в течении 30 минут, после чего доводят уровень воды до первоначального объема. Затем фильтруют через бумажный фильтр, окончательно устанавливают насыщенным расвором гидрокарбоната натрия или 10% раствором едкого натра требуемую реакцию, стерилизуют 15-20 минут при температуре +120⁰С. Если после стерилизации в мясо-пептонном бульоне выпадает осадок, его фильтруют вторично и снова стерилизуют. Вторичная стерилизация производится при более низкой температуре, чем предшествующая, для предотвращения выпадения осадка.

4. Мясо-пептонный агар
К 1л мясной воды прибавляют 1г пептона и 0,5г хлорида натрия, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный таким образом бульон фильтруют, устанавливают слабощелочную реакцию (рН 7,2-7,4) и добавляют 0,2-2г измельченного агар-агара (в зависимости от качества агар-агара и назначения среды). После добавления агар-агара жидкость кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. При помутнении среды ее просветляют. Приготовленный агар фильтруют или декантируют, разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют в автоклаве при температуре +120⁰С в течение 20 минут.

5. Сахарный бульон (бульон с глюкозой)
К 1л мясопептонного бульона нейтральной реакции прибавляют глюкозу в количестве 0,25мг-2г. Перед добавлением к бульону глюкозу растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Приготовленную среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут или однократно в автоклаве при температуре +115⁰С 30 минут.

6. Триптический перевар Хоттингера
Говяжье мясо освобождают от костей, жира, сухожилий, нарезают мелкими кусочками, взвешивают и опускают в кипящую воду из расчета 1 кг мяса на 1 л воды. Мясо кипятят в течение 15-20 минут, затем вынимают и пропускают через мясорубку. Бульон смешивают с фаршем и сливают в бутыль с таким расчетом, чтобы 1/3 бутыли оставалась свободной. К горлышку бутыли подбирают хорошо пригнанную резиновую пробирку. Смесь подщелачивают 20% раствором питьевой соды до рН 7,8-8,0, прибавляют очищенную от жира, соединительной ткани и дважды пропущенную через мясорубку поджелудочную железу в количестве 10% к имеющемуся объему (на 1 л жидкости 100 г железы). Вместо панкреатической железы можно прибавить панкреатин в количестве 0,5% и выше в зависимости от его активности.
Через 1-2 часа после добавления фермента проверяют реакцию перевара и подщелачивают его повторно до рН 7,4-7,5. Отсутствие сдвига реакции смеси в сторону окисления после прибавления фермента указывает на его недоброкачественность.
Содержание бутыли тщательно перемешивают, добавляют хлороформ из расчета 10-30 мл на каждый литр перевара. Бутыль плотно закрывают резиновой пробкой и ставят в термостат при +37⁰С на 7-10 суток. В течении первого дня содержимое бутыли перемешивают вначале каждые 15-20 минут, затем через 2-3 часа, а в последующие дни – по нескольку раз в день, открывая при этом пробку для выхода избытков паров хлороформа. При стоянии в термостате мясо ферментируется, преврящаясь в однородный осадок серовато-желтого цвета, а жидкость из мутно-серой становится совершенно прозрачной, соломенно-желтого цвета. Об окончании переваривания судят по образованию триптофана, обнаруживаемого следующим образом: в пробирку наливают 3-4 мл фильтрованного перевара, добавляют 3-4 капли бромной воды. При наличии триптофана жидкость принимает розово-фиолетовый цвет.

Приготовление бромной воды. На 100 мл дистиллированной воды берут 3-3,5 мл чистого брома для получения насыщенного раствора. Хранят в склянке темного стекла.

7. Кровяной агар
Расплавляют 1л 2% мясо-пептонного стерильного агара, охлаждают его до температуры +45⁰С и прибавляют 5-10мл дефибринированной стерильно взятой крови лошади, кролика или барана. Добавление крови производят, соблюдая правила стерильности. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри (предварительно нагретые в термостате), дают ей застыть и подсушивают в термостате. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный
цвет.

---

8. Бульон на переваре Хоттингера
Для приготовления бульона основной перевар Хоттингера разводят в несколько раз дистиллированной или водопроводной водой, добавляя на 1л бульона 0,5мг хлорида натрия, 1мг двузамещенного фосфата калия, устанавливают рН 7,4-7,6 и кипятят 15-20 минут.
Приготовленный таким образом бульон фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, разливают во флаконы или пробирки и стерилизуют при температуре +120⁰С в течение 20-30 мин.

9. Желточно-солевой агар (Чистовича)
Для приготовления желточно-солевого агара готовят впрок мясо-пептонный агар (рН 7,2-7,4) с содержанием 10% хлорида натрия. После разливки во флаконы по 100-200 мл агар стерилизуют в автоклаве в течение 20 минут при температуре +120⁰С. Перед употреблением расплавливают, охлаждают до +45-50⁰С и добавляют 20% по объему) стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150-200 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия). Среду быстро помешивают, разливают в стерильные чашки, которые продолжительное время могут
сохраняться в холодильнике.

10. Молочно-солевой агар
К 1л расплавленного мясо-пептонного агара рН 7,2-7,4, содержащего 5-7,5г хлорида натрия, добавляют 10мл стерильного теплого хорошо обезжиренного молока, тщательно перемешивают и разливают в чашки.

11. Среда Эндо
Мясо-пептонный (100 мл) агар рН 7,4 растапливают и охлаждают до температуры +70⁰С, прибавляют 1 г лактозы, предварительно растворенной в стерильной пробирке в небольшом количестве дистиллированной воды и прокипяченной. В отдельных пробирках приготовляют:
2-3 мл спиртового насыщенного основного фуксина; 10 мл 10% водного раствора сульфида натрия. В стерильную пробирку отмеривают 1 мл фуксина и прибавляют раствор сульфида натрия до обесцвечивания фуксина (бледно-розовый цвет). Приготовленную смесь вливают в растопленный агар, хорошо перемешивают и разливают по чашкам. Горячий агар имеет бледно-розовый цвет, а при застывании становится бесцветным. Среду готовят в день ее использования.

12. Среда Ресселя
К 100 мл мясо-пептонного агара (рН 7,2) прибавляют 1г лактозы, 1г глюкозы и 1 мл индикатора Андреде. Среду разливают в пробирки в количестве 5-6 мл, стерилизуют в автоклаве при +112⁰С в течение 20 минут и скашивают так, чтобы на 2-3 см от дна пробирки агар оставался в виде столбика. Ферментацию лактозы определяют по появлению малиновой окраски соответственно добавленному индикатору Андреде в скошенной части среды, сбраживание глюкозы – по окраске столбика. При сбраживании лактозы и глюкозы происходит резкое покраснение всей среды: столбика и скошенной его части. Характер изменения цвета среды Ресселя определяется не одинаковой интенсивностью расщепления микроорганизмами азотистых веществ и образованием щелочных продуктов в аэробных и анаэробных условиях.
Газообразование в среде определяют по вспениванию конденсационной жидкости на дне пробирки, а также по образованию трещин и разрывов в агаре.

---

Смотрите также файлы

• Вирусы папилломы человека и их роль в образовании опухолей.doc

• Вши человека.doc

• Гонорейная инфекция и хламидиоз у женщин.doc

• ИХТИОЗ.doc

• Клинические симптомы в дерматовенерологии.doc