ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 24.01.2020
Просмотров: 960
Скачиваний: 4
13.
Цитратный агар Симмонса
Растворяют
в 1 л дистиллированной воды сульфата
магния 2мг, фосфата натрия-аммония 1,5 г,
одноосновного фосфата калия 1 г, цитрата
натрия кристаллического 3 г, Смесь
стерилизуют в автоклаве. Прибавляют 20
г агар-агара, нагревают до его расплавления,
устанавливают рН 7,2 и затем прибавляют
1 мл 1,5% спиртового раствора бромтимолового
синего.
14. Среда
Сабуро
Помещают
18 г агара в 1 л дистиллированной воды и
дают ему набухать 30 мин, нагревают,
помешивая, пока не растворится агар,
добавляют 10 г пептона и 40 г глюкозы или
мальтозы. Стерилизация среды проводится
в течение 15 мин при +1150С.
15. Среда
Китта-Тароцци
Печень
животного, обычно говяжью, нарезают
кусочками по 1,0-1,5 г, прибавляют по весу
тройное количество мясо-пептонного
бульона или бульона Хоттингера нейтральной
реакции, кипятят 30 минут. Бульон
отфильтровывают, печень промывают под
краном на сите. Отфильтрованный бульон
разливают по 7-10 мл в пробирки. В каждую
пробирку кладут по 4-5 кусочков отмытой
печени. Бульон сверху заливают слоем
вазелинового масла и стерилизуют в
автоклаве при давлении 0,5 атм 30 минут.
16. Кровяной
агар Цейсслера
К
1л 3% мясо-пептонного агара прибавляют
1г глюкозы, устанавливают рН 7,2, разливают
во флаконы по 100 мл, стерилизуют при
давлении 0,5 атм 30 минут. Перед употреблением
к расплавленной и охлажденной до +450С
среде прибавляют 20мл свежей дефибринированной
крови. Среду разливают в чашки Петри.
17. Кровяной
сахарный агар
Агар
2% на бульоне Хоттингера в объеме 100 мл
расплавляют и охлаждают до +450С,
после чего добавляют к нему 10-15 мл
свежевзятой стерильной дефибринированной
крови кролика, барана или крупного
рогатого скота и 10 мл 20% стерильного
раствора глюкозы. Смесь взбалтывают
так, чтобы не образовалось пузырей пены,
и разливают по чашкам.
-
РЕЦЕПТЫ ИНДИКАТОРОВ
1. Индикатор
бромтимоловый синий
Бромтимоловый
синий позволяет определить изменение
реакции среды в пределах рН 6,0-7,6. В
щелочной зоне рН 7,6 индикатор имеет
синий цвет, в кислой зоне рН 6,0 – желтый.
При изменении рН в указанном диапазоне
бромтимоловый синий изменяет окраску
через различные оттенки зеленого цвета.
В нейтральной точке рН 7,0 индикатор
имеет характерный, легко запоминающийся
травянистый оттенок.
В работе
применяют раствор бромтимоловый синий,
приготовленный по следующей прописи.
Бромтимоловый синий 0,4 г растворяют
в 40 мл дистилированной воды, нагревая
ее до кипения. После этого к раствору
прибавляют 6,4 мл децинормального раствора
едкого натра, в результате чего жидкость
приобретает зеленоватый цвет, и доливают
дистиллированной водой до 100 мл.
Приготовленный таким образом индикатор
может сохраняться в темном месте в
склянке, закрытой притертой пробкой в
течении длительного времени.
2. Индикатор
Андреде
Фуксина
кислого 0,5 г растворяют в 16,4 г N раствора
гидрата окиси натрия, прибавляют 100 мл
дистиллированной воды, настаивают 24
часа при +370С,
стерилизуют при температуре +1000С
в течение 5 минут. Сохраняют во флаконах
темного стекла с притертой пробкой.
Приготовленной таким образом индикатор
имеет соломенно-желтый цвет.
При
смещении рН в кислую зону индикатор
Андреде приобретает ярко-малиновый
цвет.
3. Индикаторная
бумага на сероводород
Для
выявления сероводорода полоски
фильтровальной бумаги смачивают в
растворе следующего состава:
-
дистиллированная вода 100 мл
- ацетат
свинца 20 г
- бикарбонат натрия 1 г.
Бумагу высушивают, нарезают полосками
шириной 0,2-0,4 мм и длинной 5-6 см. Перед
употреблением бумага бесцветна, а при
образовании микробной культурой
сероводорода приобретает черно-бурый
цвет.
4. Индикаторная
бумага на индол
Полоски
фильтровальной бумаги пропитывают
следующим реактивом: парадиметиламидобензальдегид
– 5г, спирт этиловый 96% - 50 мл, фосфорная
кислота (очищенная концентрированная)
– 10 мл. После растворения порошка
полученной тепловатой жидкостью
смачивают полоски фильтровальной
бумаги, высушивают и хранят их в банке
темного стекла. Цвет бумажек желтый,
при наличии индола – серовато-розовый
до интенсивного малинового.
5. Индикатор
для обнаружения оксидазы
Нафтола
30-40 мг растворяют в 2,5 мл этилового
спирта-ректификата, добавляют 7,5 мл
дистиллированной воды и расворяют 40-60
мг диметил-П-фенилендиамина.
-
РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАЦИИ УГЛЕВОДОВ
Цветные среды
Гисса с углеводами
К
100 мл дистиллированной воды добавляют
1 г пептона, 0,5 г хлорида натрия. Пептон
и соль растворяют при нагревании воды
в течение нескольких минут, фильтруют
через бумажный фильтр так, чтобы раствор
был совершенно прозрачным, устанавливают
рН 7,0-7,4, прибавляют 0,5-1 г одного из
необходимых углеводов (лактоза, глюкоза,
сахароза, маннит и т.д.), а затем индикатор
Андреде в количестве 1 мл на 100 мл среды
или 0,1 мл 1,6% раствора индикатора
бромтимолового синего.
Готовую среду разливают по 3 мл в пробирки, простерилизованные вместе с поплавками, расположенными запаянным концом кверху. Среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 или 20 минут при температуре +1120С. Во время стерилизации поплавки заполняются доверху питательной средой. Основой сред, применяемых для определения ферментации углеводов, является пептонная вода. Мясной бульон для этой цели не пригоден, так как он содержит различные углеводы, что может привести к получению неправильных результатов. Среды Гисса с индикатором Андреде имеют соломенно-желтый цвет, с индикатором бромтимоловым синим – болотно-зеленый (рН 7,0-7,2). В результате роста бактерий, сопровождающегося расщеплением углевода с образованием кислых продуктов, цвет среды изменяется: в первом случае она приобретает ярко-розовый цвет; во втором – желтый. Образование газа в среде определяют по наличию пузырьков газа, собирающихся в поплавке.
-
МЕТОД ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Использование метода газожидкостной хроматографии при диагностике БВ основано на идентификации группы веществ – продуктов метаболизма микроорганизмов, связанных с БВ, и микроорганизмов, присутствующих в норме. К числу таких метаболитов относят летучие жирные кислоты (уксусная, изопропионовая, пропионовая, изомасляная, масляная, изовалериановая, валериановая) и нелетучие органические кислоты (молочная и янтарная).
В качестве материала
для исследования используются смывы
вагинального отделяемого в физиологическом
растворе. Для этого во влагалище вводится
3 мл стерильного физиологического
раствора, делается смыв вагинального
содержимого со стенок влагалища ватным
микробиологическим тампоном и переносится
в пробирку с притертой пробкой. Для
анализа летучих жирных кислот готовятся
их эфирные экстракты. К 1 мл образца
добавляется 0,5-1 мл диэтилового эфира и
экстрагируется в пробирке со шлифом в
течении 1 минуты с помощью миницентрифуги
"Vortex". После этого эфирный экстракт
отделяется, использованием пастеровской
пипетки с небольшим количеством
безводного сульфата магния. Для анализа
нелетучих компонентов образец подвергается
метилированию: к 2 мл смыва добавляют 4
мл метанола, пробирку закрывают пленкой
и на 45 минут помещают в морозильную
камеру при температуре –200С.
Далее жидкость переливается в герметическую
пробирку и к ней добавляется 0,2 мл 50%
раствора серной кислоты, после чего
пробирка выдерживается в течении 30
минут при +800С.
По завершении процесса этерификации
содержимое пробирки
охлаждается
проточной водой и в нее добавляется 2
мл дистиллированной воды. Для экстракции
летучих эфиров используется 1 мл
хлороформа. 1 мкл подготовленных
экстрактов вводится в инжектор-хроматограф
с помощью микрошприца. В качестве эталона
используются экстракты водных растворов
летучих жирных кислот и нелетучих
органических кислот (внешний стандарт).
Для проведения газожидкостной
хроматографии возможно использование
хромотографа "Chrom-5". Хромотограф
"Chrom-5" оснащен пламенноионизационным
детектором и стеклянными колонками,
заполненными сорбентом FFAP 15% на Chromosorb
W, 80-100 mesh. Рабочие условия: температура
испарителя - +1900С,
термостата - +500С,
детектора - +2500С.
Скорость газа-носителя (азота) и водорода
30 мл в минуту, воздуха – 300 мл в минуту.
Идентификация анализируемых веществ
проводится с учетем времени их удерживания,
а концентрации анализируемых веществ
определяются по площади пика на
хромотограмме. Интерпритация результатов
проводится в соответствии с руководствами
по микробиологии и хроматографии. Метод
газожидкостной хроматографии позволяет
сравнить содержание в вагинальном
отделяемом основных продуктов метаболизма
лактобактерий и облигатно-анаэробных
микроорганизмов – молочной и янтарной
кислот. В норме соотношение янтарной и
молочной кислот составляет 0,4, а при БВ
более 0,4.
Чувствительность и специфичность метода варьируют и, по данным, зарубежных авторов, составляют от 78-81% до 100% [11]. По данным Анкирской А.С. и соавт чувствительность и специфичность метода составляют 80% и 88,6% соответственно [2]. При БВ также выявляют высокие концентрации летучих жирных кислот, продуцируемых строгими анаэробами. На практике этот метод используется редко из-за высокой степени сложности и дороговизны.
-
МЕТОД ГЕНОДИАГНОСТИКИ
Молекулярно-биологические методы идентификации нуклеиновых кислот микроорганизмов находят все более широкое применение в практической медицине. Одним из основных приложений молекулярно-биологических подходов для решения медицинских задач остается изучение бактериальной микрофлоры, населяющей организм человека в норме и патологии. Причины этого кроются в самом характере микрофлоры, проводить лабораторную диагностику которой необходимо при нарушении микробиозинозов (дисбактериоз влагалища, желудочно-кишечного тракта и т.д.). При данных патологиях классическими лабораторными методами обследования являются культуральный посев и микроскопия.
Золотым стандартом
микробиологии считается культуральный
посев - исследование, обладающее 100%
специфичностью по отношению к данному
возбудителю. Основным методическим
приемом микробиологии является выделение
и культивирование бактериальной флоры
в виде чистой культуры. Этот этап
накладывает существенные ограничения
на возможности использования
микробиологического анализа для полной
оценки состояния микрофлоры. По различным
данным мы способны культивировать не
более 15% микроорганизмов, населяющих
организм человека. Некультивируемые
микроорганизмы могут быть представлены
известными или неизвестными видами,
неспособными расти в лабораторных
условиях или находящимися в "дремлющем"
состоянии (споры). Проблема культуральной
диагностики БВ в том, что высеваемая
микрофлора представлена анаэробными
(облигатными и факультативными)
микроорганизмами и микроаэрофилами.
Если культивирование факультативных
анаэробов не представляет особой
сложности, то бактериологическое
обнаружение строгих анаэробов и
микроаэрофилов затруднено. Для проведения
адекватного бактериологического
исследования на анаэробы и микроаэрофилы
необходимо наличие специальных сред,
как транспортных, так и сред для
культивирования, а также создание
определенных условий инкубации. Несмотря
на достигнутые успехи в области создания
культуральных сред для обнаружения
Gardnerella
vaginalis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum и Mobiluncus
spp., их
культивирование и идентификация остаются
деликатной
процедурой, требующей
длительного времени и опыта. Соблюдение
всех этих требований часто оказывается
невозможным для рядовой бактериологической
лаборатории, но даже в хорошо оснащенных
клинико-диагностических центрах процент
высеваемости этих микроорганизмов
составляет 12-60 %.
Существенным недостатком культурального посева является также длительность исследования. Время роста отдельных микроорганизмов может составлять от нескольких дней до нескольких недель, в течение которых больной не получает адекватного лечения. В ряде случаев при БВ необходима видовая идентификация возбудителя (например, для представителей рода Mobiluncus, Fusobacteria), что требует дополнительных средств и времени при использовании микробиологического подхода.
Отчасти проблему обнаружения анаэробной микрофлоры в лабораторных условиях решает использование световой микроскопии с окраской мазка по Грамму. При таком обследовании легко обнаружить микроорганизмы, имеющие характерную форму и локализацию. Как сказано выше, одним из критериев БВ яляется наличие "ключевых" клеток, которые можно увидеть в урогенитальном мазке под микроскопом. Это зрелая эпителиальная клетка, по всей поверхности которой плотно и в большом количестве прикреплены мелкие граммвариабельные палочки, представляющие собой G. vaginalis. Одновременно в таком мазке можно обнаружить представителей семейства Mobiluncus, имеющих характерную форму. При окраске по Граму они вариабельны или граммотрицательны, несмотря на строение клеточной стенки, характерной для граммположительных бактерий. Это связано с очень тонким пептидогликановым слоем, что снижает эффективность прокрашивания.
Существенным недостатком микроскопического анализа мазка является невозможность видовой идентификации микроорганизмов. Качественная оценка микрофлоры заключается в характеристики только морфотипов бактерий: лактоморфотип, морфотипы гарднереллы, бактероидов, фузобактерий, мобилункуса, вейллонеллы, что является очень грубой оценкой состояния бактериальной микрофлоры.
Решить проблему быстрого и качественного обнаружения представителей анаэробной микрофлоры и микроэророфилов способны методы генодиагностики (ДНК-ДНК гибридизация и ПЦР), позволяющие выявлять микроорганизмы непосредственно в урогенитальном мазке, минуя стадию культивирования и выделения чистой культуры. Методы генодиагностики основаны на детекции ДНК возбудителя в клиническом материале. Сходство физико-химических свойств всех нуклеиновых кислот позволило создать универсальные процедуры обнаружения ДНК любых микроорганизмов в биопробе, а уникальность генетического материала каждого конкретного возбудителя легла в основу специфичности метода, позволяющего проводить видовую идентификацию. Для проведения генодиагностики не требуется забор образцов в специальные транспортные среды и создания особых условий хранения и транспортировки, что существенно снижает себестоимость проводимого анализа. При этом время проведения анализа сопоставимо по скорости с микроскопическим исследованием и составляет 4,5-5 часов.
Основным методом генодиагностики, используемым при обследовании больных с БВ, является полимеразная цепная реакция – ПЦР и ее модификации.
В основе метода ПЦР лежит комплиментарное достраивание участка геномной ДНК или РНК возбудителя, осуществляемое in vitrо с помощью фермента термостабильной ДНК-полимеразы. Специфичность метода определяется уникальностью генетического материала выявляемых инфекционных агентов, к которому подобраны олигонуклеотидные праймеры, участвующие в процессе амплификации.