Российская Академия медицинских наук

Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта

М. А. Башмакова, А. М. Савичева

Вирусы папилломы человека и их роль в образовании опухолей

Москва • МЕДИЦИНСКАЯ КНИГА

Н. Новгород • Издательство НГМА

1999

УДК 612.017

М.А. башмакова, а.м. савичева. Вирусы папилломы человека и их роль в образовании опухолей. — М.: Медицинская книга; Н. Новгород: Изд-во НГМД, 1999. — 16 с.: илл.

Пособие раскрывает роль вирусов папилломы человека в образовании опухолей. Изложены вопросы эпидемиологии, диагностики и лечения папилломавирусной инфекции.

Издание предназначено акушерам-гинекологам, венерологам, инфекционис­там, эпидемиологам, а также будет полезно широкому кругу читателей.

ISBN 5 – 86093 – 002 – X

ВВЕДЕНИЕ

Во всем мире наблюдается рост папилломавирусной инфекции. Это происходит потому, что вирус передается при половом контакте, а в со­временных условиях имеет место либерализация половых связей, раннее вступление в половую жизнь юношей и девушек, частая смена половых партнеров и большое их количество на протяжении жизни. Но папилломавирусная инфекция имеет особенности, отличающиеся от многих других инфекций, передаваемых половым путем, поскольку папилломавирусы относятся к опухолеродным вирусам, которые способны выз­вать доброкачественные, а некоторые их типы и злокачественные опухо­ли. Поэтому понятен не только биологический и медицинский интерес к папилломавирусам, но также оценка знаний об этой группе вирусов как социально значимых агентов, причастных к смертельным заболеваниям у лиц молодого возраста.

Заражение вирусом происходит при прямом контакте. Попав на кожу или слизистые оболочки, папилломавирус вызывает разрастания клеток эпителия в виде бородавок, иногда обширных образований - кондилом. Разрастания заразны, легко передаются от человека к челове­ку, обычно не вызывают метастазов, т.е. переноса в отдаленные органы и ткани, часто они самопроизвольно исчезают, как это наблюдается при юношеских бородавках.

Вирус заражает самый нижний глубокий слой кожи или слизистой оболочки, происходит усиленное размножение клеток этого слоя, что и приводит к образованию разрастании. Сам вирус в глубоких слоях не размножается, его интенсивное размножение происходит в поверхност­ных слоях — в чешуйчатых клетках, которые по мере оттеснения к по­верхности перестают делиться и становятся более пригодными для раз­множения вируса.

Вирус папилломы человека, в отличие от многих других вирусов, не размножается в культуре клеток и не может быть получен в виде массы вирусных частиц — вирионов. Однако с помощью электронного микро­скопа вирионы этого вируса обнаружены в пора женных тканях. На рис. 1 представлены вирионы папилломавируса в ткани опухоли.

Рис.1. Вирионы папилломавируса

Вирус может быть найден также с помощью современных молекулярно-биологических методов, которые основаны на обнаружении дезоксирибонуклеиновой кислоты, являющейся геномом вируса. Нуклеиновые кислоты ДНК и РНК обладают способностью к гибридизации. С помощью нагревания или действия химических веществ ДНК из двухнитевой спирали переходит в однонитевую, но сохраняет способность достраивать вторую нить, комплементарную к существующей при наличии в реагирующей среде затравок (праймеров), которые определяют направление достройки второй нити, и химических веществ для построения ДНК. Процесс воссоздания второй нити по образцу одиночной нити и/или ее части называют молекулярной гибридизацией, а участок который используют в гибридизации (участок ДНК или РНК), называют зондом. На рис. 2 схематически представлена двойная спираль ДНК и соединение составляющих ее нуклеотидов.

Рис. 2. Гибридизация ДНК (схема)

Благодаря молекулярно-гибридизационным методам стало известно, что существует много типов папилломавирусов, 30 из них инфицируют половые органы и область заднего прохода. У женщин инфицируется и покрывается генитальными бородавками область преддверия влагалища, стенки влагалища, шейка матки, наружное отверстие уретры. У мужчин поражается головка полового члена, крайняя плоть, мошонка, анальная область. В родах папилломавирус передается новорожденному ребенку, вызывая у него папилломатоз гортани.

Разные типы вируса папилломы человека (ВПЧ) вызывают отличающиеся друг от друга заболевания. На рис. 3 даны возможные виды экзофитных и эндофитных разрастании, вызванных папилломавирусами.

В табл. 1 даны заболевания у людей, обусловленные папилломавирусами.

Таблица 1

Папилломавирусы человека (по Грин М., 1985)

По мере изучения гибридизационными методами ВПЧ выяснилось, что риск злокачественного перерождения связан с несколькими типами ВПЧ. Они были обозначены как вирусы высокого риска онкогенного заболевания. Это типы ВПЧ 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59 и 68. Перечень типов ВПЧ высокого онкогенного риска расширяется за счет уточнения строения ДНК и появления новых типов промежуточного риска. Вирусами низкого риска остаются 5 типов ВПЧ — 6,11,42,43,44.

Отмечено, что 16 тип наиболее часто встречается в ткани плоскоклеточного рака шейки матки, а 18 тип — в ткани железистого рака-аденокарциномы. Установлено, что существуют дозависимые отношения, т.е. при высоком содержании ДНК ВПЧ в материале, взятом из шеечного канала матки, риск опухоли или неоплазии более высок и наоборот. В табл. 2 сведены признаки, связанные с ВПЧ инфекцией, обусловленной онкогенными и неонкогенными типами ВПЧ.

Таблица 2

Различия ВПЧ инфекции в зависимости от генотипа вируса

Максимальная заболеваемость, обусловленная ВПЧ, наблюдается в возрасте от 18 до 28 лет. Однако и в старших группах в силу возрастных изменений иммунитета и гормональной функции, которые благоприятствуют многим факторам канцерогенеза, возможны проявления папилломавирусной инфекции и клеточная трансформация ракового характера.

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обширные эпидемиологические исследования о папилломавирусной инфекции были проведены в 1991 - 1997 гг. Было установлено, что большинство, если не все случаи рака шейки матки, связаны с папилломавирусной инфекцией, что имеет значение тип ВПЧ, продолжительность инфекционного процесса, поскольку заражение происходит в юношеском возрасте. Характер половых связей как женщин, так и мужчин является главным фактором риска инфицирования, наибольший фактор риска - большое количество половых партнеров и у женщин, и у мужчин.

При массовых исследованиях ВПЧ обнаружен у 40 - 50% молодых женщин, но в большинстве случаев вирус спонтанно исчезает, лишь у 5 - 15% ВПЧ вызывает хроническую инфекцию шейки матки, реже - вульвы и влагалища. Те женщины, у которых длительно персистирует ВПЧ в шейке матки, по сравнению с теми, у которых нет этого вируса, находятся под высоким риском (примерно 65-кратным) развития рака шейки матки. Риск еще выше (130-кратный) у женщин старше 30 лет, если они инфицированы типами ВПЧ высокого онкогенного риска, включая в первую очередь типы 16 и 18. При клинически установленном раке шейки матки ВПЧ современными методами исследования обнаруживается во всех случаях.

Рак шейки матки и предшествующие ему состояния до недавнего времени определяли преимущественно цитологическими методами. Здесь уместно отметить, что цитологическая диагностика в большой степени связана с опытом работы врача — микроскописта и, разумеется, с тем как взят материал из эндоцервикса для цитологического исследования. Различия в оценке одного и того же клеточного препарата разными исследователями достигают 20%. Подтверждением неопределенного результата цитологического исследования служит кольпоскопическое исследование с обработкой пораженных участков слизистой раствором Люголя. При такой обработке участки плоского эпителия, пораженные ВПЧ, выглядят побелевшими и приподнятыми над окружающей тканью, дают картину мозаики, лейкоплакии. Имеют значение четкость границ йод-негативного эпителия.

Применение методов определения ДНК ВПЧ повышает эффективность выявления предраковых состояний, во-первых потому, что чувствительность метода исключительно велика, его предсказательный уровень неизмеримо выше, чем цитологического, во-вторых, совпадение данных цитологического исследования и ВПЧ-диагностики позволяет избежать кольпоскопического исследования.

На рис. 4 приводим последовательность обследования больных при обнаружении атипичных клеток в мазках из шейки матки. Предлагается также использовать одновременное исследование материала взятого из шейки матки как цитологическими методами, так и применением ДНК-диагностики. Многочисленными работами установлено, что в 99% случаев наличие ДНК ВПЧ сопровождается наличием в шейке матки клеточных дисплазий разной степени выраженности.

Комбинированный метод обследования больных, как показал опыт его применения, помогает в 100% случаев выявить цервикальную интраэпителиальную неоплазию (ЦИН) высокой степени выраженности - 2 и 3 ее степени, а тестирование ВПЧ в комбинированном методе служит квалифицированным индикатором присутствия ВПЧ с разграничением типов высокого, среднего и низкого онкогенного риска.

Рис. 4. Порядок обследования при обнаружении атипичных клеток

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДНК-ДИАГНОСТИКИ ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

Если в материале, взятом из эндоцервикса, обнаруживается присутствие ВПЧ, это служит довольно строгим предсказательным признаком клеточной дисплазии и возможности опухолевой трансформации клеток.

• Обобщенные данные показывают, что наибольшее количество цервикальных интраэпителиальных неоплазий возникает у женщин, инфицированных вирусами папилломы человека.

• Прогрессирование клеточного перерождения в большой степени связано с типом ВПЧ; находки ДНК ВПЧ типов высокого онкогенного риска - 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56 и 58 дают основание предполагать, что клетки эпителия могут скорее всего подвергнуться злокачественному перерождению.

Напротив, нахождение только типов низкого онкогенного риска - 6,11,42,43 и 44 - очень редко при раке шейки матки.

• Высокий уровень содержания ВПЧ связан с тяжестью заболевания.

• Повторные определения ДНК ВПЧ в комбинации с цитологией мазка из шейки матки могут служить альтернативой кольпоскопии. Они могут представить возможность увеличения интервалов между обследованиями у женщин с отрицательными данными цитологического исследования. Принимая во внимание психологические аспекты, важно избежать частых повторных осмотров пациенток, а взятие единственной пробы для цитологического определения клеточных изменений и определения ДНК ВПЧ делает обследование женщин более экономичным, более объективным и более квалифицированным.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

В лабораторной диагностике практически применяют исключительно ДНК-методы. Существуют три основных категории лабораторных методов определения ДНК ВПЧ: неамплификационные, амплификационные и сигнальные амплификационные (табл.3).

Таблица 3

Методы обнаружения ДНК вирусов папилломы человека

Неамплификационные методы определения ДНК ВПЧ в настоящее время с диагностической целью не используются. Они в ходу в научно-исследовательских лабораториях.

Среди амплификационных методов наибольшее распространение получила ПЦР, благодаря которой были получены ценные сведения о типах ДНК. Однако постановка ПЦР имеет большое количество ограничений, чтобы не получить ложноположительных результатов. Ограничения в первую очередь касаются строгого разграничения и разобщения по отдельным помещениям разных этапов работы, строгого соблюдения правил пользования перчатками, халатами, лабораторным оборудованием в пределах помещения, предназначенного для определенного этапа исследования, иначе может случиться перенос какого-либо количества ДНК с последующим его намножением в ПЦР. Кроме того, в мире еще нет стандартных реактивов для всех типов ВПЧ, практически используются праймеры и другие реактивы собственного лабораторного изготовления.

Не останавливаясь подробно на мишень-амплификационных методах, обратимся к сигнальным амплификационным методам, которые не требуют тех ограничений в деятельности, которые характерны для ПЦР-лабораторий. Среди них привлекает внимание система двойной генной ловушки - Digene Hybrid Capture System II фирмы Abbott, которая обеспечивает:

- количественный анализ;

- компьютерную интерпретацию результатов, что исключает субъективизм в оценке;

- воспроизводимость и достоверность результатов;

- полный цикл исследования в течение одного рабочего дня;

- абсолютную специфичность.

Система двойной генной ловушки - Digene Hybrid Capture System II использует РНК-ДНК гибридизацию в растворе с последующей "хвостовой" иммунологической реакцией между гибридом РНК пробы - ДНК мишени и специфическими антителами к этому гибриду. Тест обязан своей высокой специфичностью нескольким независимым источникам.

Во-первых, весь геном вируса является мишенью. Длинная одноцепочечная РНК эффективно гибридизуется со всеми 8000 нуклеотидов ДНК ВПЧ. Гибрид ДНК-РНК более стабилен, что позволяет избежать нежелательных побочных реакций.

Во-вторых, источником дополнительной чувствительности в реакции является использование антител к гибриду РНК-ДНК, конъюгированных с множеством молекул щелочной фосфатазы. Эти меченные антитела распознают короткие цепочки РНК-ДНК гибрида способом, который не имеет отношения к последовательностям нуклеотидов ДНК и РНК. Тысячи молекул антител могут покрыть единичный геномный гибрид ДНК ВПЧ.