ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 09.09.2020
Просмотров: 7665
Скачиваний: 75
160
жабы» или «Изменения гельминтофауны самцов и самок серой жабы». Цель:
сравнительный анализ зараженности земноводных разного возраста и стадий
развития (требуются выборки головастиков, сеголеток, неполовозрелых и поло-
возрелых особей) или половой принадлежности (сравниваются выборки поло-
возрелых самок и самцов).
Оборудование и реактивы.
С целью проведения гельминтологического
исследования необходим определенный набор оборудования, инструментов,
химических реактивов и расходных материалов. Прежде всего, гельминтологу
не обойтись без бинокулярного микроскопа. Объемное видение объектов поз-
воляет находить и извлекать гельминтов быстро и без повреждения. Позднее
для их видовой диагностики понадобится еще и бинокулярный микроскоп с
сильным увеличением. Необходимо также иметь инструменты для вскрытия
животных и извлечения гельминтов; химическую посуду, стекла и реактивы
для фиксации, камеральной обработки материала, приготовления препаратов и
другие принадлежности. Ниже приведено основное необходимое оборудование
и реактивы на разных этапах исследования:
Подготовительный этап: емкости для содержания отловленных амфибий,
бумажный скотч, маркер, холодильник.
Гельминтологическое вскрытие: дневник вскрытия, эфир, вата и емкость
для наркоза, штангенциркуль, бинокуляр МБС-8-10, несколько пар давильных
стекол размером 10×10 см (удобнее, если верхнее стекло немного меньше ниж-
него), кювета для вскрытия, препаровальные ножницы и пинцеты разного раз-
мера и формы, скальпель, препаровальные иглы, чашки Петри диаметром 10 см
(для внутренних органов) и 4–6 см (для гельминтов), покровные стекла разме-
ром 24×24 мм, набор грузиков для аптекарских весов, часовое стекло, зажигал-
ка (спиртовка), дозатор или лабораторная пипетка с резиновой грушей, пробир-
ки Эмпендорфа (объемом 1,5–2 мл), материальные банки для упаковки проби-
рок с гельминтами, эксикатор для отходов. Реактивы: спирт этиловый 70%-ный,
жидкость Барбагалло, вода.
Окраска и изготовление препаратов: в дополнение к вышеуказанному по-
требуется лабораторная посуда (колбы, пипетки, мерный цилиндр, мензурки)
для приготовления и хранения реактивов нужной концентрации, предметные и
покровные стекла, фильтровальная бумага, набор реактивов (см. пункт «6.3.3.
Окраска и изготовление препаратов»). Применение оборудования и реактивов в
ходе исследования рассмотрено ниже при описании методики.
Для начала изучения гельминтофауны достаточно собрать минимальный
набор оборудования и реактивов для препарирования животных и фиксации
гельминтов, а обрабатывать пробы и монтировать препараты с целью видовой
диагностики можно позднее, например, по окончании полевого сезона.
После подготовки лабораторного оборудования приступают к поиску и
отлову земноводных. Для этого можно воспользоваться рыболовным сачком,
удочкой или же отловить животных вручную; в долгосрочной перспективе (что
характерно, для наземных видов амфибий) применяют ловушки – специальные,
разработанные герпетологами, способы отлова с помощью ловчих цилиндров,
161
канавок и заборчиков. Отловленных земноводных помещают в емкость для
хранения с небольшим количеством воды на дне и доступом воздуха. На ем-
кость наклеивается этикетка с указанием даты и места отлова, вида и числа
особей. Та же информация с добавлением описания биотопа отлова, точных ко-
ординат местности и прочей полезной информацией дублируется в полевом
блокноте, а по окончании экспедиции переносится в лабораторный дневник
вскрытий.
Рекомендуется помещать емкости с амфибиями в холодильник не сразу
после отлова, а через некоторое время, чтобы их кишечник освободился от
остатков пищи, которые сильно мешают при поиске гельминтов и источают не-
приятный запах. Для этого животных оставляют на 1–2 суток в емкостях при
комнатной температуре. В последствие грязную воду с остатками пищи про-
сматривают на наличие гельминтов; при необходимости собирают и фиксируют
пищевые компоненты для трофологического исследования. При отлове нужно
иметь в виду, что содержать земноводных в холодильнике без ущерба для ис-
следования можно до 3–4 недель. При длительном содержании животное может
погибнуть (особенно это касается вышедших из спячки и ослабленных особей).
Перед его гибелью гельминты начинают покидать тело хозяина или меняют ло-
кализацию. На первых порах не следует отлавливать много земноводных сразу,
достаточно 5–6 особей. Это позволит без спешки и переутомления осваивать
методы полного гельминтологического вскрытия. Тем более что длительность
первых вскрытий может составить до 4–8 ч. в зависимости от интенсивности
заражения. Поэтому вряд ли получится изучить более 1–2 лягушек в сутки. С
приобретением профессиональных навыков скорость вскрытия станет в разы
выше.
7.3.2. Гельминтологическое вскрытие
Усыпление и препарирование амфибии.
Умерщвление земноводных путем
декапитации или разрушения мозга с помощью зонда или препаровальной иглы
(т.е. способами фиксации, принятыми для физиологических экспериментов) не
соответствует целям паразитологического исследования, так как нарушает це-
лостность органов локализации и местоположение гельминтов. Вместо этого
производится усыпление животного под эфирным наркозом. Для этого лягушку
помещают в банку с кусочком ваты, смоченной эфиром, и закрывают плотной
крышкой. Все манипуляции проводятся в хорошо проветриваемом помещении.
Через 15–20 мин. усыпленную лягушку извлекают и помещают в кювету для
препарирования.
Общий порядок паразитологического исследования:
1.
Оттягивая кожу на брюхе пинцетом, производят несколько разрезов
препаровальными ножницами для получения доступа к внутренним органам и
полости тела. Ориентировочный порядок разрезов брюшной стенки тела указан
на рисунке 7.1.
162
Рисунок 7.1. Порядок разрезов при вскрытии амфибии
2.
Внутренние органы поочередно извлекают и помещают в отдель-
ные чашки Петри с небольшим количеством воды. Порядок извлечения органов
определяется их анатомическим расположением и для удобства производится в
направлении от брюха к спине: 1) сердце, печень и желчный пузырь; 2) легкие;
3) ЖКТ, мочевой пузырь, яичники с яйцеводами; 4) почки, жировые тела, се-
менники. Оставшуюся часть тушки амфибии накрывают влажной салфеткой и
оставляют для завершающего этапа исследований.
3.
Последовательно рассматривают извлеченные внутренние органы
под бинокуляром, собирают и фиксируют гельминтов. Порядок исследования
может быть произвольным и определяется удобством для исследователя.
4.
На завершающем этапе исследования с тушки амфибии снимают
кожу, срезают и рассматривают под бинокуляром мускулатуру конечностей и
языка, брюшные стенки.
5.
В последнюю очередь извлекают и обследуют головной, спинной
мозг и глаза.
Изучение внутренних органов, поиск, сбор и фиксация гельминтов.
Для
получения общего представления о наличии гельминтов внутренние органы
осматривают компрессорным методом. Для этого орган помещают на нижнее
давильное стекло, пипеткой добавляют немного воды, накрывают его сверху
вторым стеклом и нажимают до состояния, когда содержимое органа станет ви-
димым на просвет. В таком виде органы просматривают под бинокуляром в
проходящем свете, замечая примерное количество и расположение гельминтов.
Затем снимают верхнее стекло и извлекают гельминтов при помощи пипетки и
препаровальных игл. Данным способом исследуют паренхиматозные органы
(печень, почки, жировые тела, гонады). Давильные стекла после использования
промывают струей воды над эксикатором и вытирают насухо салфеткой или
полотенцем.
Полостные органы (легкие, желудок, кишечник, прямая кишка, мочевой и
желчный пузырь) при наличии гельминтов вскрывают ножницами. Гельминтов
кишечника извлекают с применением метода внутренних соскобов содержимо-
163
го скальпелем в чашку Петри, которое заливают водой и аккуратно с помощью
груши доводят до однородного состояния. По мере оседания гельминтов на
дно, их подсчитывают и собирают пипеткой или иглами. Для удобства можно,
подкручивая рукой чашку Петри, сконцентрировать в ее центре всех червей.
При обнаружении выростов на стенке двенадцатиперстной кишки (трематода
Brandesia turgida
), их вскрывают глазными ножницами или препаровальными
иглами изнутри.
Аналогично компрессорным методом просматривают части мускулатуры
конечностей, куски кожи, язык и глаза земноводных. Завершают вскрытие ис-
следованием головного и спинного мозга методом последовательных смывов на
наличие метацеркарий трематод. Для этого ножницами вскрывают нижний свод
черепа, позвоночный столб и производят смыв содержимого струей воды в
чашку Петри. При обнаружении под бинокуляром личинок трематод смывы
повторяют.
Фиксация гельминтов разных систематических групп имеет свои отличия,
поэтому нужно научиться проводить предварительную идентификацию их по
классам.
Взрослые стадии (мариты) трематод, или дигенетических сосальщиков,
разного размера и формы – от вытянутой до круглой – с двумя присосками, ло-
кализуются, как правило, в легких, кишечнике, мочевом пузыре и ротовой по-
лости. После извлечения гельминта переносят препаровальными иглами, пи-
петкой или кисточкой в чашку Петри с каплей воды, накрывают покровным
стеклом для расправления и подпускают пипеткой 70%-ный спирт под край
стекла (излишки оттягивают фильтровальной бумагой). Крупные экземпляры
трематод дополнительно прижимают грузиком, который подбирают с учетом
размера гельминта: чем больше червь, тем тяжелее грузик. Для расправления
мелких особей достаточно прижимающей силы поверхностного натяжения
жидкости, которую можно регулировать, добавляя или оттягивая её по краям
стекла. Если гельминты мелкие, то их удобнее располагать группами под одним
покровным стеклом. В таком виде червей оставляют на 10–20 минут (в зависи-
мости от размера), после чего переносят в отдельную (по месту локализации)
пробирку с 70%-ным спиртом и этикетируют.
Личинки трематод (метацеркарии), как правило, заключены в округлые
цисты, форма, размеры и толщина оболочки которых являются важными диа-
гностическими признаками. Они располагаются обычно в паренхиме и на се-
розных покровах внутренних органов, в полости тела, брыжейках, жировой
ткани, толще мускулатуры и даже цереброспинальной жидкости. Для видовой
диагностики необходимо аккуратно, не повредив червя, извлечь его из цисты,
для чего оболочку осторожно разрывают препаровальными иглами
.
Плотную
гиалиновую оболочку трематод рода
Strigea
растворяют с помощью трипсина,
антиформина, искусственного желудочного сока или бытовых хлорсодержащих
средств «Белизна», «Ace». В последнем случае несколько капель средства до-
бавляют в чашку Петри с водой, содержащей метацеркарии трематод, и под би-
нокуляром контролируют процесс истончения покровов цист. Не дожидаясь
164
окончательного растворения оболочки, метацеркарий переносят в чистую воду,
где с помощью игл окончательно освобождают личинок от остатков цисты. По-
сле извлечения и промывки в воде личинок фиксируют и распрямляют в 70%-
ном этаноле по методу, описанному выше для взрослых стадий трематод, пере-
носят в пробирку и этикетируют.
Другой, предыдущий по стадийности развития, тип личинок трематод –
мезоцеркарии – отличается рыхлыми оболочками и заметной подвижностью (в
Мордовии обычны мезоцеркарии трематоды
Alaria alata
). Мезоцеркарии часто
локализуются в жировой и мышечной тканях, а их эксцистирование нужно про-
водить осторожно во избежание деформации. Далее, извлеченных личинок со-
бирают пипеткой (дозатором), фиксируют в процессе распрямления в 70%-ном
этаноле, переносят в пробирку и этикетируют.
Моногенеи у земноводных встречаются, как правило, в мочевом пузыре и
представлены в средней полосе России крупной листовидной
Polystoma
integerrimum
c множеством присосок. Для распрямления их помещают под по-
кровное стекло с грузиком, проводя те же манипуляции, что и с трематодами.
Впоследствии червей переносят в пробирку с 70%-ным спиртом и этикетируют.
Цестоды (ленточные черви) у амфибий достаточно редки. Они имеют вид
ленты из одинаковых члеников, которая способна к медленным сократительно-
расслабляющимся движениям. По возможности червя фиксируют в 70%-ном
спирте целиком или частично, но обязательно со сколексом и несколькими зре-
лыми члениками, несущими диагностические признаки вида.
Нематоды могут иметь разные размеры, веретеновидную или нитчатую
форму. Взрослые особи обычно локализуются в полостных органах (кишечник,
легкие); личинки редки и, как правило, инкапсулированы в стенках внутренних
органов, мускулатуре, брыжейках. Их извлекают препаровальными иглами и
переносят иглой или кисточкой на часовое стекло в жидкость Барбагалло. В
процессе фиксации отдельные виды нематод из легких и кишечника часто сво-
рачиваются в клубок или спираль, что делает дальнейшее их определение очень
неудобным. Во избежание этого, часовое стекло с раствором не сильно (иначе
паразит лопнет!) подогревают над пламенем спиртовки (зажигалки) до момента
распрямления червя. Данная методика применима не ко всем видам нематод,
например, она не подходит для крупной и хрупкой нематоды
Icosiella neglecta
,
встречающейся в мускулатуре языка, конечностей и под кожей. После рас-
прямления нематод переносят в отдельную по месту локализации пробирку с
жидкостью Барбагалло и этикетируют. Применяется также фиксация нематод в
70%-ном спирте.
Скребни у земноводных встречаются редко и внешне похожи на нематод;
передний конец тела несет ввернутый внутрь и усаженный крючьями хоботок, с
помощью которого они вбуравливаются в стенки кишечника хозяина. Строение
хоботка имеет важное (главное) диагностическое значение. Поэтому скребней
фиксируют, придавливая покровным стеклом с грузиком, подобранным таким
образом, чтобы его масса приводила к выпячиванию хоботка наружу. По отно-
шению к скребням в качестве фиксаторов применимы два варианта. Можно ис-