ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 09.09.2020
Просмотров: 7669
Скачиваний: 75
165
пользовать жидкость Барбагалло (оптимально для изучения крючьев хоботка и
просветления в глицерине) или 70%-ный спирт (для последующей окраски кар-
мином и изучения внутреннего строения). В придавленном виде скребней
оставляют до завершения вскрытия амфибии, после чего переносят в отдельные
пробирки с фиксатором и этикетируют.
Этикетирование и хранение материала.
Всех гельминтов после сбора и
фиксации помещают в отдельные пробирки с этикетками. Червей одной систе-
матической группы из разных органов (отделов кишечника) лучше разделять по
разным пробиркам, так как информация о локализации может быть полезной
при определении и дальнейшем анализе. Но для экономии в одной пробирке
можно поместить вместе разных гельминтов из одного органа (части кишечни-
ка). На этикетке пробирки указывают номер пробирки, номер вскрытия, сокра-
щенно обозначают вид хозяина и локализацию паразитов, по возможности ука-
зывают другую информацию. Этикетку для пробирок пишут карандашом на
плотной бумаге (кальке, пергаменте) и вкладывают внутрь. Пробирки с фикси-
рованным материалом помещают в материальные банки с герметичной крыш-
кой и заливают тем же фиксатором, который находится внутри пробирок. Такая
организация хранения позволяет избежать порчи материала по причине испаре-
ния фиксатора из-под неплотных пробок. На банку помещают общую этикетку.
В процессе гельминтологического исследования ведут лабораторный
дневник вскрытий. В него заносится предварительная информация: дата и по-
рядковый номер вскрытия (можно разделить косой чертой или тире общий по-
рядковый номер и номер вскрытия данного вида), название вида животного-
хозяина, сведения об отлове (дата, место, биотоп, фамилия ловца и др.), длина
тела, пол, стадия развития. В процессе вскрытия в дневнике указывают локали-
зацию, количество, класс и стадию развития обнаруженных гельминтов, поряд-
ковый номер пробирки. Например, такая запись может иметь следующий вид:
09.09.13
Rana arvalis
№56/15
отлов: 15.08.13, МГПЗ им. П.Г. Смидовича,
биотоп: смешанный лес; 1 км севернее п. Пушта (Чупакабрин О.К.)
L= 65 мм, ♂
легкие: 9 нематод (пробирка 125), 2 трематоды (пр. 126)
тонкая кишка: 31+5 нематод (пр. 127)
стенка кишечника: 8+2+1 метацеркарий (пр. 128)
мочевой пузырь: 1 моногенея (пр. 129)
жировые тела: ок. 90 личинок фикс. частично (пр. 130)
В дневник также вносят прочую информацию, которую исследователь
считает полезной: подробное описание мест и условий отлова, наличие травм,
уродств у хозяина и повреждений паразитами внутренних органов, содержимое
желудочно-кишечного тракта, морфологические промеры хозяина и паразитов,
фенетические признаки хозяина, рисунки и др.
166
7.3.3. Окраска и изготовление препаратов
Перед заключением фиксированного паразита в постоянный (тотальный)
препарат необходимо провести его предварительную камеральную обработку.
Существуют также методы создания препаратов без предварительной фиксации
червей, применение которых требует наличия особого опыта (см. Быховская-
Павловская, 1969).
Фиксированных в спирте
моногеней, цестод
и
трематод
для избавления
от остатков фиксатора переносят в солонку (чашку Петри) с дистиллированной
водой и отмачивают минимум 2–3 ч. (особо крупных особей можно оставить и
на ночь). После этого воду сливают и заливают раствор квасцового кармина для
окраски, длительность которой зависит от свежести красителя и времени хра-
нения паразита в фиксаторе. Свежеприготовленный кармин прокрашивает
гельминта в течение нескольких минут до темно-бордового (малинового) цвета;
давно фиксированных гельминтов можно оставить в красителе на ночь. После
окраски червя промывают в дистиллированной воде в течение 15 мин., избавляя
его от излишков краски. Затем воду сливают и приступают к дифференцировке
подкисленным 70%-ным спиртом в течение 15–30 мин., контролируя процесс
под бинокуляром. Суть ее – в обесцвечивании паренхимы паразита, на фоне ко-
торой становятся более заметными границы внутренних органов и структур.
Далее гельминтов обезвоживают, прогоняя по 15–30 мин. через батарею спир-
тов возрастающей крепости: 70%, 80%, 90%, 96% и абсолютный. После этого
червя иглой переносят в раствор диметилфталата для просветления, длитель-
ность которого зависит от величины объекта и составляет от нескольких минут
до часа. После того, как гельминт полностью опустится на дно раствора, он
пригоден для включения в препарат.
Мезоцеркарии
и
метацеркарии
трематод окрашиваются уксуснокислым
кармином в течение 10–15 мин., после чего проводят их дифференцировку 1%
солянокислым спиртом (контролируя процесс под бинокуляром, во избежаниие
обесцвечивания!), обезвоживание спиртами возрастающей крепости и просвет-
ление в диметилфталате.
Монтируют препараты, используя в качестве среды заключения объекта
канадский бальзам, эпоксидную смолу или глицерин-желатин. Для этого в
центр предметного стекла помещают каплю (кусочек) среды и подогревают
(расплавляют) несильным пламенем зажигалки снизу. Затем внутрь помещают
гельминта, полностью утопляют его и, прислоняя к капле среды с краю покров-
ное стекло (во избежание попадания пузырьков воздуха), аккуратно накрывают
им объект. В заключении еще раз немного подогревают препарат снизу, чтобы
среда, расплываясь, достигла краев покровного стекла.
Препарат после изготовления этикетируют с указанием номера вскрытия,
вида и местообитания хозяина, локализации паразита и фамилии исследователя.
Впоследствие после видовой диагностики наклеивают еще одну этикетку с ука-
занием названия вида, пола (для нематод и скребней) и стадии развития гель-
минта и фамилии определившего. Препараты на основе канадского бальзама
высушивают до отвердения в сушильном шкафу в горизонтальном положении
167
при температуре 40–60°С. Хранят препараты в закрытых коробках во избежа-
ние попадания пыли и прямого солнечного света.
Нематод
не окрашивают по причине толстой кутикулы, являющейся для
красителя непреодолимым барьером, а просветляют до полной прозрачности в
молочной кислоте или глицерине от нескольких часов до 2–3 дней в зависимо-
сти от размеров червя. После просветления можно проводить видовую диагно-
стику во временных препаратах в глицерине (допустимо после определения
промыть гельминта в дистиллированной воде и снова поместить в жидкость
Барбагалло для хранения). Можно создать постоянный препарат, используя в
качестве среды заключения – глицерин-желатин – по технологии, описанной
выше для трематод.
Скребней
можно подготовить к определению двумя разными путями.
Червей, фиксированных в спирте, промывают, окрашивают, дифференцируют,
обезвоживают и просветляют как трематод (для облегчения окраски крупных
особей можно проткнуть тонкой энтомологической иглой в нескольких местах).
Скребней из жидкости Барбагалло для детального изучения крючьев хоботка
просветляют в молочной кислоте или глицерине и готовят препараты так же,
как и в случае с нематодами.
Приготовление реактивов:
70% этиловый спирт.
Готовится из 96% этилового спирта путем добав-
ления к 100 мл спирта 39,2 мл воды (лучше дистиллированной).
Солянокислый (подкисленный) этиловый спирт.
К 50 мл 70%-ного
этилового спирта добавить 5–7 капель дымящейся соляной кислоты (HCl).
Абсолютный (100%) этиловый спирт.
Медный купорос (CuSO
4
•
5H
2
O),
помешивая стеклянной (не металлической!) палочкой, прокаливают под вытяж-
кой в фарфоровой чашке до перехода его голубой окраски в серовато-белую
(желтый цвет – признак порчи реактива). Обезвоженный медный купорос всы-
пают в бутыль на 1/4 ее объема, заливают сверху 96%-ный этиловый спирт и
закрывают притертой пробкой. Содержимое бутыли взбалтывают и оставляют
на 2–3 дня.
Жидкость Барбагалло.
В 1 л дистиллированной воды растворить 9 г
хлорида натрия (NaCl), затем добавить 30 мл 40%-ного формалина.
Квасцовый кармин.
В 200 мл дистиллированной воды растворить 10 г
алюмокалиевых квасцов, затем добавить 1 г мелко истертого кармина. Проки-
пятить 10–15 мин., охладить, отфильтровать и добавить 1–2 кристалла тимола
для предотвращения развития плесени.
Уксуснокислый кармин.
45 мл ледяной уксусной кислоты разбавить
55 мл дистиллированной воды, всыпать 3–4 г кармина, кипятить в течение часа
на медленном огне для получения насыщенного раствора. Дать отстояться от
осадка и профильтровать. Для приготовления рабочего раствора 1 мл краски
развести в 2 мл 45%-ной уксусной кислоты.
Глицерин-желатин.
7 г пищевого желатина размочить в течение 2–3 ч. в
43 мл дистиллированной воды, прибавить 50 г глицерина и 0,5 г кристалличе-
168
ской карболовой кислоты. Все вместе нагревать на водяной бане, профильтро-
вать, чуть охладить и разлить по небольшим склянкам. Для удобства извлече-
ния кусочков желатина лучше не заполнять склянки полностью и оставить за-
стывать их под уклоном для образования косой поверхности.
7.3.4. Видовая диагностика
Определение видовой принадлежности гельминтов ведут по постоянным
(тотальным), реже – временным и прижизненным препаратам, рассматривая их
в микроскоп и сравнивая увиденную ультраструктуру с описанием (а не только
с рисунками!) в справочнике-определителе. На данном этапе исследования обя-
зательна проверка правильности определения опытным специалистом. По мере
запоминания исследователем анатомии и морфологии отдельных видов гель-
минтов и появлением опыта их прижизненной диагностики, надобность в изго-
товлении препаратов со временем отпадает.
7.3.5. Обработка и интерпретация данных
Для количественной характеристики инвазии гельминтами используются
следующие паразитологические показатели: 1) экстенсивность инвазии
(ЭИ, %), или процент заражения хозяина паразитами одного вида;
2) интенсивность инвазии (ИИ, экз.), или минимальное (min) и максимальное
(max) количество паразитов одного вида; и 3) индекс обилия (ИО, экз.), или
средняя численность паразитов одного вида. Расчет значений экстенсивности
инвазии традиционно проводится при объеме выборки не менее 15 экземпля-
ров, в противном случае, указывается число зараженных особей от общего ко-
личества вскрытых.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Литература по общей гельминтологии:
Догель В.А. Общая паразитология. Л.: Изд-во Ленинградского ун-та, 1962. 464 с.
Шульц Р.С., Гвоздев В.Е. Основы общей гельминтологии (в 3-х томах). М.: Наука,
1970 (Т. 1, 492 с.), 1972 (Т. 2, 515 с.), 1976 (Т. 3, 248 с.).
Методика гельминтологического исследования и обработки материала:
Аниканова В.С., Бугмырин С.В., Иешко Е.П. Методы сбора и изучения гельминтов
млекопитающих. Учебное пособие. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2007.
145 с.
Быховская-Павловская И.Е. Паразитологическое исследование рыб. Л.: Наука, 1969.
108 с.
Быховская-Павловская И.Е. Паразиты рыб. Руководство по изучению. Л.: Наука, 1985.
121 с.
Валовая М.А., Кавтарадзе Д.Н. Микротехника. Правила, приемы, искусство, экспери-
мент. М.: Изд-во Московского ун-та, 1993. 240 с.
Воейков Ю.А., Ройтман В.А. Опыт использования эпоксидной смолы ЭД-6 для приго-
товления постоянных препаратов трематод и цестод // Паразитология. 1980. Т. 5, Вып. 3.
С. 164-165.
Гусев А.В. Методика сбора и обработки материалов по моногенеям, паразитирующим
у рыб. Л., Наука, 1983. 47 с.
169
Дубинина М.Н. Паразитологическое исследование птиц // Методы паразитологиче-
ских исследований. Вып. 4. Л.: Наука, 1971. 140 с.
Иванов А.В., Полянский Ю.И., Стрелков А.А. Большой практикум по зоологии беспо-
звоночных (3-е изд.). Часть 1. Простейшие, губки, кишечнополостные, гребневики, плоские
черви, немертины, круглые черви. М.: Высшая школа, 1981. 504 с.
Маркевич А.П. Методика и техника паразитологического обследования рыб. Киев,
1950. 24 с.
Мусселиус В.А., Ванятинский В.Ф., Вихман А.А. Лабораторный практикум по болез-
ням рыб. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1983. 296 с.
Скрябин К.И. Метод полных гельминтологических вскрытий позвоночных, включая
человека. М.: Изд-во Московского ун-та, 1928. 45 с.
Судариков В.Е. Новая среда для просветления препаратов // Вопросы биологии гель-
минтов и их взаимоотношений с хозяевами: Тр. Гельминтологической лаборатории
АН СССР (ГЕЛАН). 1965. Т. 15. С. 156-157.
Судариков В.Е., Шигин А.А. К методике работы с метацеркариями трематод отряда
Strigeidida // Тр. Гельминтологической лаборатории АН СССР (ГЕЛАН). 1965. Т. 15.
С. 158-166.
Справочники по систематическим группам гельминтов:
Быховский Б.Е. Моногенетические сосальщики, их система и филогения. М.: Изд-во
АН СССР, 1957. 509 с.
Галактионов К.В., Добровольский А.А. Происхождение и эволюция циклов трематод.
СПб.: Наука, 1998. 405 с.
Гинецинская Т.А. Трематоды, их жизненные циклы, биология и эволюция. Л.: Наука,
1968. 411 с.
Гинецинская Т.А., Добровольский А.А. Частная паразитология (в 2-х томах). М.:
Высшая школа, 1978 (Т. 1, 303 с.), 1978 (Т. 2, 292 с.).
Основы нематологии (в 29-и томах) / Под ред. акад. К.И. Скрябина. М.: Изд-во АН
СССР, Наука, 1949-1979.
Основы цестодологии (в 14-и томах) / Под ред. акад. К.И. Скрябина. М.: Изд-во АН
СССР, Наука, 1951-2006.
Определитель паразитических нематод (в 4-х томах) / Под ред. акад. К.И. Скрябина.
М.: Изд-во АН СССР, 1949-1954.
Петроченко В.И. Акантоцефалы домашних и диких животных (в 2-х томах). М.:
Наука, 1956 (Т. 1, 431 с.), 1958 (Т. 2, 458 с.).
Скрябин К.И. Трематоды животных и человека. Основы трематодологии (в 26-и то-
мах). М.: Изд-во АН СССР, Наука, 1947-1978.
Судариков В.Е., Шигин А.А., Курочкин Ю.В., Ломакин В.В., Стенько Р.П., Юрло-
ва Н.И. Метацеркарии трематод – паразиты пресноводных гидробионтов Центральной Рос-
сии // Метацеркарии трематод – паразиты гидробионтов России. Т. 1. М.: Наука, 2002. 298 с.
Хохлова М.Г. Акантоцефалы наземных позвоночных фауны СССР. М.: Наука, 1986.
277 с.
Определители гельминтов позвоночных разных систематических групп:
Гвоздев Е.В., Контримавичус В.Л., Рыжиков К.М., Шалдыбин В.Л. Определитель
гельминтов зайцеобразных СССР. М.: Наука, 1970. 232 с.
Козлов Д.П. Определитель гельминтов хищных млекопитающих СССР. М.: Наука,
1977. 276 с.
Определитель гельминтов грызунов фауны СССР. Цестоды и трематоды / Под ред.
К.М. Рыжикова. М.: Наука, 1978. 232 с.
Определитель гельминтов грызунов фауны СССР. Нематоды и акантоцефалы / Под
ред. К.М. Рыжикова. М.: Наука, 1979. 272 с.
Определитель паразитов пресноводных рыб фауны СССР (в 3-х томах). Л.: Наука,
1984 (Т. 1, 429 с.), 1985 (Т. 2, 425 с.), 1987 (Т. 3, 584 с.).