Файл: Учебное пособие для высших сельскохозяйственных учебных заведений по специальности Ветеринарная медицина.pdf

144
В луночки молочно-контрольной пластинки ПМК-1 вносят 1млтщательно перемешанно- го молока и добавляют к нему 1 мл 2,5% раствора мастоприма. Молоко с реактивом перемешива- ют в течение 10 -15 с и учитывают реакцию.
На пластинке ПМК-1 при отрицательной реакции жидкость однородная, желе не образует- ся. Такое молоко не имеет примеси анормального молока или примесь незначительная (2-З%).
Положительная реакция - образуется желеобразный сгусток, степень которого оценивается в крестах.
Один крест (+) - слабое желе, смесь молока с реактивом тянется за палочкой в виде нити, на дне уже заметна небольшая выемка. Такое молоко содержит в среднем 4-б% анормального молока и до 500 тыс./мл соматических клеток.
Два креста (++) - более выраженный желеобразный сгусток, при перемешивании которого хорошо видна выемка, но желе из луночки еще не удается выбросить. Такое молоко содержит в среднем 9-10% анормального молока и от 500 тыс. до 1 млн./мл соматических клеток.
Три креста (+++) - хорошо сформированный желеобразный сгусток, который легко можно выбросить палочкой из луночки пластинки. Такое молоко содержит выше 15% анормального молока и свыше 1 млн./мл соматических клеток.
Проба с маститодиагностом (реактив Загаевского). Для приготовления маститодиагноста
300 г сульфанола и 50 г триполифосфата натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды при температуре 70-75°С. После полного растворения смеси и охлаждения до 20-25°С добавляют 0,2 г бромтимолового синего и 3 мл 1% спиртово-водного раствора розоловой кислоты и тщательно перемешивают в течение 3-5 мин, после чего реактив фильтруют через ватный фильтр.
Срок хранения приготовленного реактива - 3-3,5 месяца при температуре 5°С.
Для исследования берут 2 мл тщательно перемешанного сборного молока, вносят в луноч- ку молочно-контрольной пластинки ПМК-1, добавляют 1 мл маститодиагноста и перемешивают палочкой в течение 5-10 с.
Учет реакции проводят по изменению консистенции и цвета смеси молока с реактивом.
Гомогенная смесь молока с реактивом (-) - отсутствие примеси анормального молока в сборном.
Наличие единичных слизистых тяжей и хлопьев (±) - примесь анормального молока 1-
5%.
Умеренное содержание жидкой слизи и хлопьев(+)

145 1) В колбу Кьельдаля помещают последовательно несколько стеклянных бусинок или ку- сочков фарфора, 10 г калия сернокислого, 0,5 г окиси ртути или 0,04 г сернокислой меди. В бюксу отмеривают 5 мл молока, взвешивают с точностью до 1 мг, по разнице между массой бюксы с молоком и массой пустой бюксы устанавливают массу взятого молока.
В колбу добавляют 20 мл серной кислоты, закрывают грушеобразной стеклянной пробкой и осторожно круговыми движениями перемешивают содержимое.
2) Колбу ставят в нагревательный прибор под углом 45° и осторожно нагревают до тех пор, пока не прекратится пенообразование и содержимое колбы не станет жидким. Затем сжигание продолжают при более интенсивном нагревании. Степень нагревания считают достаточной, когда кипящая кислота конденсируется в середине горловины колбы.
Периодически содержимое колбы перемешивают, смывая обуглившиеся частицы со сте- нок. Нагревают до тех пор, пока жидкость не станет совершенно прозрачной и практически бес- цветной (при применении в качестве катализатора окиси ртути) или слегка голубоватой (при катализаторе сернокислой меди).
3) После осветления раствора нагревание продолжают в течение 1,5 ч, затем дают остыть до комнатной температуры. Добавляют 150 мл дистиллированной воды и несколько кусочков свежеприготовленной пемзы, перемешивают и снова охлаждают
4) В коническую колбу отмеривают 50 мл борной кислоты, добавляют 4 капли индикатора и .перемешивают. Коническую колбу соединяют с холодильником с помощью аллонжа и резино- вой трубки так, чтобы конец аллонжа был ниже поверхности раствора борной кислоты в кониче- ской колбе.
5) Колбу Кьельдаля соединяют с холодильником при помощи каплеуловителя, проходяще- го через одну пробку с делительной воронкой. Градуированным цилиндром отмеривают 80 мл раствора натрия гидроокиси, и через делительную или капельную воронку вносят его в колбу
Кьельдаля. Сразу же после выливания раствора закрывают кран делительной воронки во избежа- ние потерь образующегося аммиака.
Содержимое колбы осторожно смешивают круговыми движениями и нагревают до ки- пения. При этом избегают пенообразования.
Продолжают перегонку до тех пор, пока жидкость не начнет вскипать толчками. При этом регулируют степень нагрева так, чтобы время дистилляции было не менее 20 мин. Убедиться в полноте перегонки аммиака можно путем дополнительной перегонки в новую порцию борной кислоты (20 мл) в течение 5 мин. Окраска раствора борной кислоты, должна оставаться без изме- нений. При перегонке не допускается нагревание раствора борной кислоты в конической колбе.
Перед окончанием перегонки опускают коническую колбу так, чтобы конец аллонжа оказался под поверхностью раствора борной кислоты, и продолжают перегонку в течение 1-2 мин.
Прекращают нагревание, отсоединяют аллонж, в коническую колбу омывают внешнюю и внутреннюю поверхности аллонжа небольшим количеством дистиллированной воды.
6) Титруют дистиллят 0,1н раствором соляной кислоты до перехода зеленого цвета в фио- летовый.
Параллельно проводят контроль анализа так же, как и основной, применяя 5 мл дистилли- рованной воды вместо молока.
Обработка результатов
Массовую долю общего белка (X) в процентах вычисляют с точностью до третьего деся- тичного знака по формуле
1,4 х 0,1К (V
1
-Vо)х6,38
Х=-------------------------------------- m где, 1,4 - количество азота, эквивалентное 1 мл 0,1н раствора соляной кислоты, мл;
0,1 - нормальность раствора соляной кислоты;
К - коэффициент поправки раствора соляной кислоты;
V
1
- объем 0,1н НСl, израсходованной на титрование дистиллята в основном анализе, мл;
V
0
- объем 0,1н НС1, израсходованной на титрование в контрольном анализе, мл;
6,38 - коэффициент перевода массовой доли общего азота на массовую долю общего бел- ка; m - масса молока, взятого для анализа, г.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух парал- лельных определений, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 0,03%. б) Общего белка пробой с нейтрализованным формалином и едким натром
Подготовка к анализу:
1) Нейтрализация формалина.

146
На 100 мл 36-40% раствора формалина добавляют 0,5 мл2%раствора фенолфталеина и по каплям вносят раствор щелочи (30-40%), а в конце нейтрализации - 0,1н раствор едкого натра до появления слабо-розовой окраски.
Лучше нейтрализовать небольшую порцию формалина и использовать ее для анализа в те- чение одного дня. Как недостаточная, так и излишняя нейтрализация формалина приводит к ошибке. Формалин хранят в темном месте при температуре б-9°С. При долгом хранении форма- лина в условиях низкой температуры появляется осадок. Пользоваться таким формалином можно после фильтрации его через бумажный фильтр.
2)Приготовление сернокислого кобальта. 2,5 г сернокислого кобальта вносят в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят до метки дистиллированной водой. Срок хранения раствора сернокислого кобальта - не больше б месяцев.
Проведение анализа:
В химический стакан отмеривают 20 мл молока, добавляют 2,5 мл 2% спиртового раствора фенолфталеина и нейтрализуют 0,1н раствором едкого натра (без учета количества его) до появле- ния розовой окраски, совпадающей с цветом эталона. Для получения эталона в стакан такой же емкости отмеривают 20 мл того же молока и 1млраствора сернокислого кобальта.
Затем в стакан с молоком вносят 4 мл 36-40% раствора нейтрализованного формалина, перемешивают круговыми движениями и через 1 мин титруют из бюретки 0,1н раствором едкого натра до появлений розовой окраски, которая должна совпадать с цветом эталона. Количество децинормального раствора едкого натра отсчитывают с точностью до 0,05 мл. Делают не менее двух параллельных определений, расхождения между которыми не должны быть более 0,05 мл щелочи.
Обработкарезультатов:
Количество 0,1н раствора едкого натра, затраченного на титрование пробы молока после добавления формалина, умножают на коэффициент 0,959 и округляют до 0,001. Полученное произведение показывает содержание общего белка в молоке в процентах. в) общего белка с помощью приборов
Используют датские электронные приборы «Промилк МК2», «Милко-Скан 100», «Милко-
Скан 203», «Милко-Скан 300 ―.
В молоке клинически здоровых коров количество общего белка составляет 3,3-4,I% в за- висимости от породы. При воспалительном процессе в молочной железе количество общего белка возрастает. г) азота и аммиака реактивом Несслера.
Приготовление реактива Несслера:
30 г ртути двуйодистой, 26 г калия йодистого растирают в ступке с 30 мл дистиллирован- ной воды и переносят в мерный цилиндр со 160 мл 50% раствора едкого натра. По окончании бурной реакции ступку ополаскивают, содержимое цилиндра доводят дистиллированной водой до
1 л. Реактив выдерживают 3-4 суток в темном месте, после чего он готов к употреблению.
Проведение анализа:
1) Определение общего азота.
Пробу молока разводят дистиллированной водой 1:100. К 0,25 мл разведенного мо- лока добавляют 0,5 мл 10% раствора серной кислоты и подогревают для минерализации. Ко- гда раствор значительно потемнеет, добавляют по каплям перекись водорода до посветления и подогревают 3-5 мин. для окончательной минерализации. После охлаждения приливают 3,5 мл дистиллированной воды и 1,5 мл реактива Несслера. Сразу после добавления реактива определяют оптическую плотность на приборе «Спекол» при длине волны 470 нм.
Обработка результатов:
Полученную цифру оптической плотности умножают на 10 000.
2) Определение азота сыворотки молока
К 10 мл обезжиренного центрифугированием (при 6 тыс. оборотах в 1 мин) в течение 10 мин молока добавляют 400мг сульфосалициловой кислоты, хорошо перемешивают и ставят в холодильник на 1ч. Осадок отцентрифугируют в течение 5 мин при 3 тыс. оборотах в 1 мин.
Подученную сыворотку разводят в 20 раз дистиллированной водой. Затем проводят минерализа- цию и определяют оптическую плотность как при определении общего азота.
Обработка результатов:
Полученную цифру оптической плотности умножают на 200.
3) Определение остаточного азота.

147
К 1 мл сыворотки молока, полученной на предыдущем этапе, добавляют 1 мл дистиллиро- ванной воды и 2 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и выдерживают в холодильни- ке 2 ч. После чего отцентрифугируют при 3 тыс. оборотах в 1 мин. в течение 5 мин. Затем прово- дят минерализацию и определяют оптическую плотность как при определении общего азота.
Обработка результатов:
Полученную цифру оптической плотности умножает на 100.
4) Определение аммиака
Анализу подвергают молоко не ранее чем через 2 ч после окончания доения. В стакан от- меривают 20 мл молока, нагревают в водяной бане до 40-45°С, добавляют 1 мл 10% уксусной кислоты, оставляют для осаждения казеина на 10 мин. Пипеткой отбирают 2 мл отстоявшейся сыворотки, переносят в пробирку, добавляют 1 мл реактива Несслера и содержимое сразу же перемешивают, наблюдая при этом в течение не более 1 мин изменение окраски смеси.
Обработка результатов:
Чувствительность метода составляет 6-9 мг% аммиака. Появление лимонно-желтой окра- ски смеси указывает на присутствие аммиака, характерного для молока.
Появление оранжевой окраски различной интенсивности указывает на наличие аммиака выше его естественного содержания. д) мочевины по цветной реакции с диацетилмонооксимом.
Мочевина образует с диацетилмонооксимом в присутствии тиосемикарбазида и солей же- леза в кислой среде окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию мочевины в молоке.
Подготовка к анализу:
Реактивы.
1)Приготовление 25% раствора диацетилмонооксима. 250 мг вещества растворяют в 9,75 мл дистиллированной воды. Реактив стоек.
2)Приготовление основного раствора хлорного железа. 5 г хлорного железа растворя- ют и доводят дистиллированной водой до 100 мл, затем прибавляют 1 мл концентрированной серной кислоты.
3)Приготовление рабочего раствора хлорного железа. 1 мл основного раствора хлорного железа доводят до 100 мл дистиллированной водой, затем добавляют 8 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл 85% ортофосфорной кислоты. Хранят в темной посуде. Годен в течение 2 недель.
4) Приготовление раствора тиосемикарбазида. 250 мг тиосемикарбазида или 320 мг тиосе- микарбазида соляно-кислого растворяют соответственно в 97,5 и 96,8 мл дистиллированной воды, получают 0,25% и 0,32% растворы.
5)Приготовление цветного реактива. К 30 мл рабочего раствора хлорного железа добавля- ют 20 мл дистиллированной воды, 1 мл 25% раствора диацетилмонооксима и 0,25 мл 0,25% рас- твора тиосемикарбазида. Цветной реактив готовят каждый раз перед употреблением.
6)Приготовление стандартного 0,025% раствора мочевины.
Берут 250 мг мочевины, в сушильном шкафу при температуре 105°С доводят до постоян- ного веса, а затем растворяют в 1 л дистиллированной воды. В качестве растворителя можно использовать 0,2% раствор бензойной кислоты (0,2 г кристаллической бензойной кислоты раство- ряют в 100 мл дистиллированной воды при интенсивном помешивании и нагревании на водяной бане). Стандарт, приготовленный на растворе бензойной кислоты, более стабилен, чем водный.
При работе на ФЭК оба раствора должны давать небольшое количество экстинции. В противном случае готовят новый стандартный раствор.
7) 10% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ)
Оборудование:
1. Фотоэлектроколориметр.
2. Центрифуга.
3. Водяная баня.
4. Центрифужные пробирки.
5.Алюминиеваяфольга.
Проведение анализа:
Обезжиривание молока. Для этого его центрифугируют 20минпри 4000-5000 об/мин, верхний слой (жир) удаляют, а оставшуюся часть сливают в пробирку, закрывают резиновой пробкой и хранят в холодильнике.
В центрифужную пробирку вносят 0,8 мл дистиллированной воды, 0,2 мл обезжиренного молока и 1 мл 10% раствора ТХУ. Перемешивают и оставляют на 10-20 мин. Центрифугируют 15-
20 мин при
3000 об/мин. В чистую пробирку вносят 0,5 мл прозрачной надосадочной жидкости и 5

148 мл цветного реактива. Пробирку закрывают резиновой пробкой, обернутой алюминиевой фольгой, выдерживают в кипящей водяной бане 80 мин (точно) и охлаждают под струѐй горячей воды.
Измерение проводят на ФЭК при длине волны 500-600 нм (зеленый светофильтр) против контроля в кювете с толщиной слоя 1 см не позднее чем через 15 мин после охлаждения.
Контроль ставят, как и опытную пробу, но вместо надосадочной жидкости берут 0,5 мл дистиллированной воды. Одновременно определяют мочевину в стандартной пробе. Стандартную пробу обрабатывают аналогично опытной, но вместо обезжиренного молока берут 0,2 мл стан- дартного раствора мочевины.
Обработка результатов:
Расчет проводят по формуле.
Е оп
Х = ------------- х 25,
Е ст где Х - концентрация мочевины, мг%
Еоп - экстинция опытной пробы;
Ест - экстинция стандартной пробы;
25 - концентрация мочевины в стандартном растворе, мг%
В молоке клинически здоровых коров содержание мочевины составляет 20-40 мг%, в мо- лозиве первого удоя - 15-20 мг%, молозиве 5-го дня —18-24 мг%. е) Электрофоретическое определение сывороточных белков.
В щелочных буферных растворах большая часть белков ведет себя как кислота и движется к аноду. Скорость движения различных белков в электрическом поле различная. Сывороточные белки молока путем электрофореза можно разделить на четыре основных группы: сывороточный альбумин, бета-, альфа-лактоглобулины, иммунные глобулины. При рН 7,9 все эти белки в элек- трическом поле движутся к аноду, так как они при этом становятся отрицательно заряженными.
Наиболее быстро движется сывороточный альбумин, затем бета-лак-тоглобулин, за ним альфа-лактоглобулин, наконец,иммунные глобулины.
Оборудование:
1)
Прибор для электрофореза на бумаге.
2)
Центрифуга.
3) Холодильник.
4) Потенциометр (рН-метр).
5) Пипетки и микропипетки.
Реактивы:
1)
Приготовление 20% раствора уксусной кислоты. 200мл ледяной уксусной ки- слоты вносят в мерную колбу объемом 1 л и доливают до метки дистиллированной водой.
2)
Приготовление веронал-оксалатного буфера рН7,9.
Раствор № 1: 36,8 г веронала и 24 мл 30% раствора едкого натра растворяют в дистилли- рованной воде, доводя общий объем до 2 л.
Раствор № 2: 4,5 г щавелевой кислоты растворяют в дистиллированной воде, доводя объем до 1 л.
Раствор № 3: 1560 мл раствора № 1 смешивают с 480 мл раствора № 2. Если рН ниже 7,9, добавляют несколько капель щелочи, при более высоком рН - щавелевокислую кислоту.
3) Приготовление раствора красителя. 100 мг кислотного сине-черного красителя раство- ряют в 450млэтилового спирта, добавляя в него 50 мл ледяной уксусной кислоты, или 0,2 г бромфенолового синего и 1 г хлористойртути растворяют в 100 мл 2% раствора уксусной кисло- ты, или 2 г хлористого аммония, 10 г каломеди, 1 г бромфенолового синего растворяют в 1 л дистиллированной воды. Профильтровать и использовать через сутки.
4)Растворы для отмывания электрофореграмм.
100 мл ледяной уксусной кислоты и 40 г перегнанного фенола доводят дистиллированной водой до 1л, или 50 мл ледяной уксусной кислоты доводят дистиллированной водой до 1 л.
5) 0,1н едкий натр
Проведение электрофореза:
1) Для исследования берут 30-40мл молока, подогреваютдо40°С и центрифуги- руют при 1500-2000 об/мин в течение 10 мин.
2) Молоко помещают в холодильник на 10-15 мин, после чего пипеткой или шпа- телем снимают жир. Следы жира (0,2-0,З%), оставшиеся в молоке, не мешают дальнейшему анализу.
3) Для отделения казеина к обезжиренному молоку добавляют по каплям 20% ук- сусную кислоту, доводя реакцию молока до рН 4,6 (изоэлектрическая точка ка-