ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 16.04.2021
Просмотров: 14279
Скачиваний: 135
показание флуориметра раствора рабочего стандартного образца рибофлавина; В1 - то же после
гашения флюоресценции; 500; V2 и V3 - разведения в миллилитрах; 0,0004 - содержание
рибофлавина в 1 мл раствора рабочего стандартного образца в миллиграммах; а - навеска препарата в
граммах или количество таблеток, покрытых оболочкой; б - средняя масса одного драже или одной
таблетки в граммах; 1000 - пересчет в граммы.
Примечание. Приготовление раствора рабочего стандартного образца рибофлавина: 0,0400 г
рибофлавина, предварительно высушенного при температуре от 100 до 105 град. С в течение 2 ч,
растворяют в горячей воде в мерной колбе вместимостью 1 л при подогревании на водяной бане,
после охлаждения доводят объем раствора водой до метки (основной раствор). Раствор годен в
течение 1 мес при хранении в банке оранжевого стекла с притертой пробкой при температуре от 5 до
10 град. С.
1 мл основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем
раствора водой до метки; 1 мл раствора рабочего стандартного образца содержит 0,0001 мг
рибофлавина.
Раствор годен в день приготовления.
5. Определение содержания
пиридоксина гидрохлорида (витамина B6)
Точную навеску порошка растертых драже, таблеток или количество таблеток, покрытых
оболочкой, растертых в порошок, указанных в соответствующих частных статьях, количественно
переносят водой в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки,
перемешивают и фильтруют; первые 10 мл отбрасывают. Из полученного раствора готовят раствор
второго разведения с таким расчетом, чтобы содержание в нем пиридоксина гидрохлорида было
около 0,01 мг в 1 мл; 5 мл полученного раствора переносят в делительную воронку вместимостью 50
мл, прибавляют 10 мл фосфатного буферного раствора (0,2 моль/л), 1 мл 0,1% раствора диэтил-п-
фенилендиамина сульфата, перемешивают, прибавляют 10 мл этилацетата, 2 мл 1% раствора калия
феррицианида и немедленно тщательно перемешивают. Дают слоям разделиться, нижний водный
слой сливают в колбу и оставляют для повторного извлечения, верхний этилацетатный слой
фильтруют через сухой бумажный фильтр, на который помещено около 8 г безводного натрия
сульфата, в мерную колбу вместимостью 25 мл. Нижний водный слой повторно извлекают 10 мл
этилацетата, фильтруют, фильтр промывают этилацетатом, присоединяют его к первому извлечению
в мерной колбе и доводят объем раствора этилацетатом до метки. Измеряют оптическую плотность
полученного раствора синего цвета на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре при длине
волны 600 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют
этилацетат.
Параллельно проводят опыт с раствором рабочего стандартного образца пиридоксина
гидрохлорида. Для этого 5 мл раствора рабочего стандартного образца пиридоксина гидрохлорида
помещают в делительную воронку и далее поступают так, как описано выше.
Содержание C8H11NO3 х HCl (пиридоксина гидрохлорида) в одном драже или одной таблетке
в граммах (X) вычисляют по формуле:
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья –
Постоянно действующий третейский суд.
D1 х 0,01 х 100 х V3 х б D1 х V3 х б
Х = -------------------------- = --------------------,
D0 х а х V2 х 1000 D0 х а х V2 х 1000
где D1 - оптическая плотность испытуемого раствора; D0 - оптическая плотность раствора рабочего
стандартного образца пиридоксина гидрохлорида; 0,01 - содержание пиридоксина гидрохлорида в 1
мл раствора рабочего стандартного образца в миллиграммах; 100, V2 и V3 - разведения в
миллилитрах; а - навеска препарата в граммах или количество таблеток, покрытых оболочкой; б -
средняя масса одного драже или одной таблетки в граммах; 1000 - пересчет в граммы.
Примечания. 1. Приготовление раствора рабочего стандартного образца пиридоксина
гидрохлорида: 0,0500 г пиридоксина гидрохлорида растворяют в воде в мерной колбе вместимостью
250 мл и доводят объем раствора водой до метки (основной раствор). Раствор годен в течение месяца
при хранении в склянке оранжевого стекла с притертой пробкой при температуре от 5 до 10 град. С.
5 мл основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем
раствора водой до метки.
1 мл раствора рабочего стандартного образца содержит 0,01 мг пиридоксина гидрохлорида.
Раствор годен в день приготовления.
2. Приготовление фосфатного буферного раствора (0,2 моль/л) рН 6,9 - 7,1:
1) 71,64 г натрия фосфата двузамещенного (Na2HPO х 12Н2О) растворяют в воде в мерной колбе
вместимостью 1 л и доводят объем
раствора водой до метки;
2) 27,22 г калия фосфата однозамещенного (КН2РО4) растворяют в воде в мерной колбе
вместимостью 1 л и доводят объем раствора водой до метки;
3) 150 мл раствора натрия фосфата двузамещенного смешивают со 100 мл раствора калия
фосфата однозамещенного.
рН полученного раствора 6,9-7,1 (потенциометрически).
Раствор годен в течение 5 сут при хранении при температуре от 5 до 10 град. С.
3. Приготовление раствора сульфата диэтил - п - фенилендиамина: 0,1 г сульфата диэтил - п -
фенилендиамина (ч. д. а. или ч.) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят
объем раствора водой до метки и перемешивают.
Раствор готовят непосредственно перед употреблением.
6. Определение цианокобаламина (витамина В12)
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья –
Постоянно действующий третейский суд.
Содержание цианокобаламина определяют микробиологическим методом с Escherichia coli 113-3
в качестве тест - микроорганизма.
Точную навеску порошка растертых драже, таблеток или количество таблеток, покрытых
оболочкой, растертых в порошок, указанное в соответствующих частных статьях, количественно
переносят водой в мерную колбу определенной вместимости и доводят объем раствора водой до
метки, перемешивают и фильтруют. Из полученного раствора делают разведение 1% раствором
натрия цитрата с таким расчетом, чтобы концентрация раствора для анализа была близкой к
контрольной концентрации раствора Государственного стандартного образца - 0,05 мкг в 1 мл.
В чашки Петри (6 чашек для построения стандартной кривой и 3 чашки для раствора
испытуемого препарата) одинакового диаметра с ровным и плоским дном, установленные на
горизонтальном столе, отрегулированном по ватерпасу, разливают по 10-12 мл расплавленной и
охлажденной до температуры 48-50 град. С основной среды, засеянной суспензией Е. coli 113-3 из
расчета от 4 до 6 мл суспензии на 200 мл основной среды. После застывания среды на каждой чашке
стерильным бором делают по трафарету под углом 60 град. С друг к другу 6 лунок диаметром 8 мм.
В три лунки (через одну) 6 чашек, используемых для построения стандартной кривой, и 3 чашек
- для раствора испытуемого препарата, вносят по 0,1 мл раствора Государственного стандартного
образца контрольной концентрации (0,05 мкг/мл). В три лунки (через одну) каждых 3 чашек вносят по
0,1 мл одной из концентрации остальных растворов Государственного стандартного образца, а также
раствора испытуемого препарата. Чашки выдерживают в термостате при 37 град. С от 16 до 18 ч.
После этого измеряют диаметры зон стимуляции роста тест - микроорганизма для каждой
концентраций растворов Государственного стандартного образца.
После измерения зон роста для всех концентраций рассчитывают среднюю величину зоны,
учитывая в каждом случае 3 чашки, т. е. 9 зон, затем рассчитывают среднюю величину зоны для
контрольной концентрации, учитывая все чашки, т. е. 27 зон.
По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации раствора (0,05 мкг/мл),
выведенной из всех чашек, и средней величиной зоны контрольной концентрации раствора
Государственного стандартного образца, выведенной из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией,
находят поправку к величине зоны данной концентрации. Найденную поправку прибавляют к
средней величине зоны данной концентрации, если она положительная, и вычитают, если она
отрицательная. Аналогичным образом делают поправку к концентрации раствора испытуемого
препарата.
Содержание C63H88CoN14O14P (цианокобаламина) в одном драже или одной таблетке в
граммах (X) вычисляют по формуле:
С х б х К
Х = -------------,
а х 1 000 000
где С - содержание цианокобаламина в 1 мл испытуемого раствора, найденное по стандартной
кривой, в микрограммах; К - коэффициент разведения; а - навеска препарата в граммах или
количество таблеток, покрытых оболочкой; б - средняя масса одного драже в граммах; 1 000 000 -
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья –
Постоянно действующий третейский суд.
пересчет в граммы.
Примечания. 1. Приготовление раствора Государственного стандартного образца
цианокобаламина: 0,0250 г Государственного стандартного образца цианокобаламина в пересчете на
100% вещество растворяют в 25% спирте в мерной колбе вместимостью 250 мл и доводят объем
раствора тем же спиртом до метки.
1 мл полученного раствора содержит 100 мкг цианокобаламина (основной раствор).
Раствор годен в течение 2 мес при хранении при температуре 4-6 град. С в банке оранжевого
стекла с притертой пробкой. 1 мл основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100
мл и доводят объем раствора водой до метки (рабочий раствор). Раствор годен в течение 5 сут при
хранении при температуре от 12 до 15 град. С.
1 мл рабочего раствора содержит 1 мкг цианокобаламина. Из рабочего раствора
Государственного стандартного образца в день определения готовят растворы, содержащие 0,025;
0,05 и 0,075 мкг цианокобаламина в 1 мл. Для этого соответственно 2,5; 5 и 7,5 мл рабочего раствора
Государственного стандартного образца помещают в мерные колбы вместимостью 100 мл, доводят
объемы растворов в колбах 1% раствором натрия цитрата до метки и перемешивают.
Раствор, содержащий 0,05 мкг цианокобаламина в 1 мл, принимают за раствор
Государственного стандартного образца контрольной концентрации.
2. Построение стандартной кривой: по исправленным значениям величин зон приготовленных
концентраций и средней величине зоны контрольной концентрации из всех чашек строят
стандартную кривую, откладывая на оси абсцисс концентрации цианокобаламина в мкг/мл, а на оси
ординат - соответствующие им величины диаметров зон роста. По полученным точкам вычерчивают
кривую.
Применяемые для построения кривой концентрации не должны отличаться от контрольной
концентрации более чем на -40 или +50%.
3. Хранение и подготовка тест - культуры для анализа: музейную культуру выращивают на
скошенной агаровой среде и хранят в холодильнике. Один раз в месяц культуру пересеивают на
свежую среду и после переноса выдерживают от 16 до 18 ч при 37 град. С.
Состав среды для хранения культуры:
казеинового кислотного гидролизата 10% 6 мл
калия фосфата двузамещенного (х. ч.) 0,02 г
железа сульфата (х. ч.) 0,0005 г
магния сульфата (х. ч.) 0,02 г
L-аспарагина (ч.) 0,02 г
глицерина (ч.) 0,2 г
агара микробиологического 1,5 г
цианокобаламина 10 мкг
воды до 100 мл
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья –
Постоянно действующий третейский суд.
рН среды до стерилизации 7,0 (потенциометрически).
Ингредиенты растворяют последовательно в воде.
Аспарагин растворяют отдельно в 10 мл воды с прибавлением 2 капель раствора
хлористоводородной кислоты (1 моль/л) при слабом подогревании и прибавляют к раствору солей;
устанавливают рН полученной смеси до 7,0 15% раствором едкого натра, доводят объем среды водой
до 100 мл, прибавляют 0,2 г глицерина и 1,5 г агара микробиологического. Смесь подогревают на
водяной бане до полного растворения агара, затем прибавляют 10 мкг цианокобаламина. За сутки до
проведения анализа тест - культуру пересевают на скошенный пептонно - солевой агар следующего
состава:
пептона ферментативного сухого 2 г
натрия хлорида (х. ч.) 0,5 г
агара микробиологического 1,8 г
воды до 100 мл
рН среды до стерилизации 7,0 (потенциометрически).
Обе среды разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют насыщенным паром под давлением в
паровом стерилизаторе при 1 ати (0,1 МПа) 20 мин. Пробирки охлаждают в наклонном положении.
На скошенный агар делают посев музейной культуры. Тест - культуру инкубируют от 16 до 18 ч при
37 град. С и используют для приготовления посевного материала.
4. Приготовление 10% казеинового кислотного гидролизата: 100 г казеина размолотого
смешивают в колбе вместимостью 1 л с 500 мл 20% раствора хлористоводородной кислоты. Смесь
нагревают с обратным холодильником в течение 24 ч. Первые 5-8 ч до растворения казеина
нагревание проводят на кипящей водяной бане, а затем на электроплитке с асбестовой сеткой. Из
полученного гидролизата при пониженном давлении отгоняют хлористоводородную кислоту. К
густому остатку прибавляют 300 мл воды, перемешивают и снова отгоняют до получения густого
сиропа. Указанную операцию повторяют дважды, растворяют оставшуюся массу приблизительно в
100 мл воды, устанавливают рН 3,5 при помощи раствора едкого натра (5 моль/л) и объем раствора
доводят водой до 1 л. К раствору прибавляют 20 г угля активированного осветляющего, встряхивают
в течение 1 ч, затем фильтруют на воронке Бюхнера с отсасыванием. Обработку углем повторяют еще
раз и получают бесцветный или светло - желтый раствор, который разливают в колбы по 100 мл и
стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при 1 ати (0,1 МПа) 20
мин.
5. Приготовление 20% раствора хлористоводородной кислоты: 425 мл концентрированной
хлористоводородной кислоты (d 1,19) разбавляют водой до 1 л.
6. Приготовление посевного материала: делают смыв суточной тест - культуры со скошенного
пептонно - солевого агара раствором натрия хлорида изотоническим 0,9%. Плотность микробной
взвеси должна быть от 1 до 2 млрд микробных клеток в 1 мл.
7. Приготовление основной питательной среды.
Состав среды:
аммония хлорида (х. ч.) 2 г
натрия хлорида (х. ч.) 3 г
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья –
Постоянно действующий третейский суд.