Файл: Методичка микробиология.doc

А) жағыннан фагозитоздың әр түрлі стадиларын анықтау, оқу

Б) аяқталмаған фагоцитоздың жұғынының микроскопиясы

Практикалық жаттығуларды орындауға әдістемелік нұсқаулар

1. B. cereus эксперименттік инфекциясын енгізгеннен кейін өлген тышқанның мәйітін бактериологиялық және бактериоскопиялық әдіспен зерттеу.

Тышқанды парафині бар ваннаға бекітеді, алдыңғы кеуде қуысын спирке батырылған мақтамен сүртіп дезинфекциялайды. Мәйітті адшу үшін стерильді инструменттерді қолданады. Алдымен сыртқы жабынын ашады, сосын кеуде қуысын, одан кейін құрсақ қуысын ашады.

Қоздырғыштың таза дақылын идентификациялау үшін бактериологиялық зеттеу жүргізу. Ол үшін қоздырғышты жүрек қанына егеді: жүректің беткейін пинцетпен қысып тұрып, пастерленген пипеткамен қанды алып, ет-пептонды сорпасы бар пробиркаға тамызады.

Құрсақ қуысын ашқан кезде бауыр, бүйрек, көкбауырға микроскопиялық зерттеулер жүргізеді.

Одан кейін тіндерден жағын дайындап, бекітіп, Грам әдсі бойынша бояп, микроскопиялайлы, яғни бактериоскопиялық зерттеу жүргізеді.

Инфекциялық аурулардың лабораториялық диагностикасы әдісі: аурулардан алынған материалды жануарларға жұқтырады, бұл әдіс биолдогиялық д.а. Диагностиканың биологиялық әдісі қоздырғышты бөліп алуға мүмкіндік береді(мысалы туляремия, оба, сібір жарасы және вирустық инфекциялар кезінде) немес токсиннің жоқтығына көз жеткізеді(ботулизм, анаэробты газды инфекциялардан биожағын алу). Кейде инфекциялар ауаулардың диагностикасын анықтауға инфицирленген жануарларда килиникалық көрінгістері және тіндер мен органдарда спецификалық патоанатомиялық өзгерістері мүмкіндік береді.

Тақырыбы: Иммунитет. Арнайы емес қорғаныш факторлары. Фагоцитоз. Опсоникалық индекс. Комплементі, лизоцимді титрлеу.

Сабақтың мақсаты:

Студент білуі керек:

• Қорғаныш механизмдері және ағзаның табиғи тұрақтылық факторлары (гуморальді және жасушалық).

Студент жасай білуі керек:

• Қанның, комплементтің, биологиялық сұйықтықтарда лизоцимнің жалпы бактерицидтік активтілігін, фагоцитозды және НСТ-тесті анықтау және есепке алу.

• Экспериментальді инфекциядан өлген тышқандарды сою және бактериологиялық зерттеу жасау.

Керекті құрал-жабдықтар: зертханалық ыдыстар, бояулар жиынтығы, тест – дақылдар, тексерілетін сарысулар, демонстрациялық препараттар (НКТ-тест, фагоцитоз т.б.), қоректік орталар.

Сабақ тақырыбын өз бетімен дайындауга арналған сұрақтар:

1. Иммунитеттің анықтамасы, түрлері. Түрлі және дара, табиғи және жүре пайда болған иммунитет.

2. Табиғи резистенттіліктің қорғаныш механизмдері және факторлары. Жануарларда және адамдарда инфекцияға резистенттіліктің генетикалық аспектілері.

3. Терінің, шырышты қабатының бактерицидті және кедергі қасиеттері. Терінің бактерицидінің индексін анықтау. Қалыпты микрофлораның манызы, терілік дисбиозы.

4. Лизоцим, оның табигаты, әсер ету механизмі. Биологиялық сұйықтарда лизоцимнің бар болуын анықтау әдісі. Интерферон.

5. Сарысудың жалпы бактерицидтік активтігі, анықтау әдістері.

6. Комплемент, оның қасиеттері, табиғи иммунитеттегі компоненттері. Пропердин, әсер ету механизмі.

7. Табиғи антиденелер, маңызы. Микрофлораның және тағамның антитендерінің маңызы.

8. Фагоцитоз-иммунитеттің клеткалы факторы. Фагоцитоздың зерттеуіндегі И.И.Мечниковтың маңызы. Фагоцит - клеткалардың түрлері, фагоцитоздың сатылары. Аяқталмаган фагоцитоз.

9. Фагоцитоз тәжірбиесін қою., реакцияның активтігін, өнімділігін және аяқталуын анықтау. Опсоно-фагоцитарлық реакция. Фагоцитозға хемотоксикалық агенттерінің әсер етуінің механизмі.

10. Фагоцитозда фагоциттердің биохимиясының ерекшеліктері.

11. Жануардың жарып союы және бактериологиялық зерттеуі (экспериментальді инфекциядан өлген).

12. Инфекцияға қарсы табиғи резистенттіліктің төмендеуіне қабілетті факторлар — ионизациялық сәулеге түсіру, ашығу және т.б.

Студенттің өзіндік жұмысы

Тапсырма 1. Қанның бактерицидтік активтігін анықтау тәжірбиенің қорытындысын есепке алу.

Қан сары суының бактерицидтік белсенділігі генотипі бөгде заттардан қанның өзіндік табиғи тазарылу көрсеткші. Қан сары суының бактерицидтік әсері алғаш рет грам оң микроорганизмдерге (сенді таяқша, ботулизм және сіреспе қоздырғышы, стафилококктар, пневмококктар, стрептококктар ж.т.б.) және де грам теріс бактерияларға (іш сүзегі салмонеллалары, бруцеллалар, менинтококктар, ішек таяқшасы, шигеллалар ж.т.б.) қарсы анықталған. Қан сары суының бактерицидтік белсенділігі организмнің түрлі жағдайында өзгеріп отырады, сондықтан оның анықтауы аурудың даму барысын, емдік шаралардың нәтижесін қадағалау және де процестің сауығу кезеңінде бақылауға болады, яғни аурудың болашағын нәтижелеуге болады.

Қан сары суының бактерицидтік белсенділігін анықтау барысында организмнің гуморалді қорғаныс факторлар қызметінің бірлігін (комплемент жүйесі, пропердин, лизоцим, қалыпты антидене, В-лизин деңгейі) анықтайды. Бюхнер тәсілі бойынша, сары судың бактерицидтік белсенділігі тексерілетін сары су мен тест-культура байланысуы нөтижесінде тәжірибеге дейін және инкубациядан соң қоректі ортада өскен тест-культура колониялар санын есептеу. Қорытындысын бақылаумен (контрольмен) салыстырады. Тәжірибеде 0.5 мл қан сары суын 0.5 мл микробтық тест-культурамен (25000 микробтық торшалар) араластырады, ал бақылауда - 0.5 мл физиологиялық ерітіндіні 0.5 мл микробтық тест-культурамен араластырады. Қоспаларды термостатқа 37°С — 60 мин қояды. Уақыт өткен соң, Петри ыдысындағы қоректік орта бетіне 0.025 мл араластырған қоспадан бактериалді ілмекпен түсіреді, шпателмен қоректік орта бетіне біркелкі жаяды. 24 сағатқа 37°С термостатта инкубация жасайды. Қан сары суы белсенділігі (ҚССБ) формуламен есептейді:

Нтәжірибе х 100

ҚССБ =100 ________________________

Н бақылау

Н — колония саны.

Тапсырма 2. Биологиялық сұйыктықта лизоцим деңгейін анықтау. Лизоцим көздің жасында, сілекейде, қан сары суында, жұмыртқа белогында ж.т.б. кездеседі. Лизоцим кейбір патогенді микроорганизмдер өсуін тежейді: стафило-, стрепто-, менинго-, гонококктардың және дифтерия коринебактериялардың. Сонымен қатар, лизоцимге көптеген сапрофиттерде сезімтал болып келеді.

Лизоцимнің биологиялық маңыздылығын ескере отырьш, оны биологиялық табиғаты бар антибиотик деп атауға болады және организмнің бейспецификалық гуморалді факторы. Осы себептен, лизоцим анықтауы аурудың дамуын, терапия нәтижесі және болжамын айқындайды.

Биологиялық сұйықтықта лизоцим деңгейін анықтау принципі, олардың ең жоғарғы титрі тест – дақылы M.lysodeicticus берілген уақытта лизиске ұшырауы

Лизоцим титрі – ең соңғы пробиркадағы (жоғары) сілекей ерітіндісі мөлдір болса.

Тапсырма 3. Лейкоциттердің фагоцитарлық активілігін анықтау (демонстрация)

Қан құрамындағы полиморфтыядролы лейкоциттер, моноциттер өз беткейлерінде микробтық тест-культураны ұстап, өзіне сіңіріп жоя алады, яғни фагоцитозға ұшыратады. Микробтық тест-культура ретінде саңырауқұлақтар, грам оң стафилококктар, грам теріс ішек таяқшасын алуға болады.

Лейкоциттерің фагоцитарлық активтілігі, оның аяқталу фазасына дейін анықтау В.М.Берман және Е.М.Славская (1958) ұсынған классикалық әдісі немесе Б.АЧухловин және С.П.Иванов (1968) модификациясы бойынша жүргізуге болады.

Бірінші әдісте тест-микроб ретінде S.aureus (Wood, 46) алынды, ал екінші модификациясында - Е.соіі штамм Ml7.

Реакция жүргізу жолдары. 0.1 мл 3% натрий лимон қышқылына 0.2 мл науқас қанын қосады, араластырған соң оған 0.1 мл алтын түсті стафилококк немесе ішек таяқша ертінділері (24 сағат инкубацияланған таза дақылдан жасалған 2-миллиардты микробтық ертінді) қосылады. Барлығын жақсылап араластырып 37°С термостатқа 30 мин. кояды. Қоспаларды жақсылап араластырып бір тамшысынан шыны затына жұқа мазок дайындайды. Қалған қоспаны қайтадан 37°С термостатқа 90 мин. қояды. Инкубация өткен соң 120 минуттық мазок дайындайды. Мазоктарды (30 минуттық және 120 минуттық) фиксация жасаған соң, Романовский-Гимзе әдісі бойынша боялады және иммерсиялық микроскопия жасалынады.

Микроскопия кезінде фагоцитозды бағалау критерийлері (инфекциялық процестің динамикасы бойынша демонстрациялық мазоктарды талдау)-

1. Активтілік - ФК (фагоцитарлық көрсеткіш) - 100 немесе 200 торша (нейтрофиддер немесе макрофаггар) ішінен фагоцитозға ұшыраған торшалардың (нейтрофилдер немесе макрофагтар) орташа %.

2. Интенсивтілігі - ФС (фагоцитарлық сан) - фагоциттеуші бір торша ішіндегі микробтар саны. Екі көрсеткіште 30 мин және 120 мин. инкубациядан соң бөлек есептелінеді

3. Аяқталғандығы - фагоцитоздың толық аяқталғаны, %(ФТА)

4. ФСК (фагоцитарлық санның коэффициенті) .

ФСК

5. НБИ (нейтрофилдердщ бактерицидтік индексі)

НБИ =

А - нейтрофил ішінде өлген микробтар саны, орташа саны;

В — лейкоциітердің жалпы микробтарды сіңіру саны.

Соң5ы көрсеткіш қор5аныс реакцияның нақты интенсивтілігін сипаттайды.

Фагоцитоздың қалыпты көрсеткіштері: ФК 40-94.18±1.55%; ФК¹²⁰ - 92.0 ±2.52%; ФС³⁰ - 11.29+1.00%; ФС¹²⁰ - 9.81+0.96%; ФСК - 1.16±0.04%; НБИ -66,3+2,58%.

Тапсырма 4. Демонстрациялық НКТ-тест.

Фагоциттердің (нейтрофилдер және макрофагтар) функционалдық активтілігін нитрокөгілдір тетразолийді қалпына келтіру реакциясында (НКТ-тест) бағалауға болады. НКТ-тесттің негізгі принципі – фагоциттер торша ішінде нитрокөгілдір тетразолий ерімейтін формасына ауысуын анықтау - диформазанды клетка ішінде есептеу. Бұл фагоциттерда метаболиттік және фагоцитарлық активтілігін сипаттайды. НКТ-тесті симптомдары бірдей бактериалді және вирусты инфекциялардың дифференциалдық диагнозын жүргізуде қолданылады. Бактериалді инфекцияларда НКТ-тесті вирустық инфекцияға қарағанда жоғары болады. НКТ-тест көрсеткіштерін антибитиктермен емдеу эффективтілігін анықтауға, қолдануға болады: ұзақ уақыт НКТ-тест көрсеткіштері жоғары болуы емге дұрыс антибиотик қолданбағанын көрсетеді. НКТ-тест бойынша фагоцитоз жүйесінің резервтік қызметін анықтауға болады, стимуляторларды ин витро қолдану арқылы.

НКТ-тест Park et ai әдісінің М.Е.Виксман және АН. Маянский модификациясы бойынша екі вариантта қойылады - спонтанды және индуцирленген түрінде. Индуцирленген вариантта стимулятор ретінде 0.005% продигиозан 1:2 ерітіндіде қолданды. Планшет шұңқырларына 0.025 мл гепарин ертіндісі (20-25 Ед/мл) еңгізіледі. Бақылау және әдістік шұңқырларына 0.025 мл тексерілетін қан қосады. Бақылау шұңқырына (спонтанды реакция) 0.025 мл фосфаттық изотониялық буфер қосылады, ал опыт шұңқырларына (стимуляторга нейтрофилдер реакциясы) 0.025 мл — продигиозан. Екі щұңқырға 0.025 мл НКТ ерітіндісі қосылады. Қоспаларды жақсылап араластырады, бетін фосфатты буферге малынған фильтр қағазымен және шыны пластинамен жабады. 37°С тсрмостатқа 15-20 мин уақытқа қояды, сосын 15 мин. бөлме температурасында ұстайды. Қан мазогындай мазок жасайды, кептіреді, фиксация жасайды және метилен көк немесе сафранинмен бояйды. Микроскопияда 100-200 нейтрофилдер немесе макрофагтар есептейді.

Организмнің спецификалық емес қорғаныс факторлары.

Берілген бөлімде бөтендігі бар агенттің антигендік ерекшілігіне тәуелсіз организмнің қорғаныс факторлары туралы жазылған.

Тері және кілегейлі қабықшаның механикалық тосқауыл функциясы, қанның әртүрлі бактерицидті заттары, қалыпты микрофлораның колонизациялық резистенттілігі, фагоциттер және комплемент жүйесі организмде қоздырғыштың болу болмауына тәуелсіз болады және өзара байланысып организмді инфекциядан сақтайтын спецификалық қорғаныс қызметін атқарады. Бұл қорғаныш күштер организмге әртүрлі жолдар арқылы енген заттарды және инфекция қоздырғыштарын генетикалық бөтендігі бар материал ретінде танымайды. Бірақ көп жағдайда жүре пайда болатын иммунитетпен салыстырғанда нәтижелі әсер етіп, элиминацияны қамтамасыз етеді. Сонымен қатар, инфекционды процесс генезіндегі спецификалық резистенттілік факторлары және инфекцияға қарсы қорғаныстың иммунды механизмдері бір-бірімен тығыз байланысты.

Тері_жабыны - инфекцияның ену жолдарының сирек түрі болып саналады. Мүйізді қабатының айтарлықтай тығыздығы, эпидермальді қабаттың әркезде жиырылуы, рН мәнін төмендететін сүт, май қышқылдарын тері және май бездері көп болуы, терінің қалыпты мик-рофлорасы антогонистік қасиеті арқылы жұқпалы ауру қоздырғыштарының адгезиямен колонизациясына қолайсыз жағдай ту­дырады. Дегенмен оба таяқшасы, лептоспира, түйнеме бацилласы сияқты микроорганизмдер тері жабынына тез енеді. Қоздырғыштар организмнің бүтіндігі бүзылғанда, бактерицидті белсінділік төмендегенде организмге енеді. Инфекциялық бастаманың ену жолдарының негізгілеріне - асқазан-ішек жолдарының кілегейлі қабықшасы, жоғарғы тыныс aлy жолдарының және сыртқы несеп-жыныс мүшелерінің кілегейлі қабықшасы жатады. Статистика барлық инфекциялық патологияның арасында ішек және респираторлы инфекцияның доминантты ролін анық көрсетеді.

Шірінді қабықшаның беткейіндегі микробүрлерлердің аймағында организмнің ішкі ортасының тұрақтылығын сақтауға, сырттан түскен бөтендігі бар заттарды, соның ішінде инфекция қоздырғышынан ескертуге бағытталған көрінбейтін бақылау болады. Шекаралы сызықтағы қаупсіздікті бақылайтын бұл қандай күш десек, өз кезінде Безредко оны жергілікті иммунитеті деп атаған. Оларды қайта атап өтейік: секреторлы иммуноглобулин А, фагоцит, комплемент, лизоцим, интерфе­рон, трансферрин, бета-лизин, өзге микробоцидті секреттер. Сонымен қатар эпителий десквамациясы, ішек перистальтикасы, жаңаратын му­цин қабаты; микроорганизмдерді жоятын кілегей сияқты механикалық факторлардың маңызы зор.

Жыбыр эпителийдің кілегеймен жабылған кірпікшелері жұтылған ауаның құрамында болатын микробтардың өзіне адсорбциялайды және тазалауды қамтамасыз етеді. Тыныс алу жолдарының төменгі бөлігінде және альвеолаларда кілегей жоқ, бірақ эпителийдің беткейі беткей-активті зат - сурфактанттың қабатымен жабылған. Ол микроорганизмдердің өсуіне және көбеюіне кедергі жасайды. Коньюктиваға түскен бактериялар жас сұйықтығымен шайылады.

Қалыпты микрофлора. Организмнің инфекциядан қорғануында ерекше орынды ашық қуыстардың кілегейлі жабынын мекендейтін қалыпты микрофлора алады. Негізінен олар ішекте, сыртқы жыныс мүшелерінде, жоғарғы ты­ныс алу жолдарында микробиоценоз түзеді. Қалыпты микрофлоранын тұрақты немесе облигатты түрлері биотопта көп жағдайда анаэробтармен берілген (бактероид, фузобактерия, бифидобактерия, лактобацилла және т.б.). Олар адгезияға және кілегейдің патогенді және шартты патогенді микроорганизмдермен колонизациясына кедергі жасайды. Обли­гатты микроорганизмдердің мұндай қасиеті колонизациялық резистенттілік деп аталады және рН ортасын 5-6 дейін төмендететін, бактериоцин, лизоцим, органикалық қышқылдардың шығарылуымен, қоректік субстраттарға бәсекелестігімен сипатталады. Одан басқа облитты микрофлора транзиторлы микроорганизмдердің адгезиясын тоқтататын кілегейдің беткейінде тығыз биопленка түзеді.

Дизодим немесе мурамидаза - микробқа қарсы қорғаныстың филогенезіндегі ежелгі факторлардың бірі болып саналады. Ең алғаш рет А Флеминг ашқан Бұл фермент, термостабильді белок қан сарысуында, сілекейде, көз жасы сұйықтығында, ликворда, ана сүтінде кездеседі. Оларды макрофагтар, моноциттер, гранулоциттер шығарады. Лизо-цимнін бактерицидтік әсері прокариот клеткаларының клетка қабықшасының қүрамына кіретін мурамин қышқылын, пептидогликанды ыдыратуында байқалады. Әсіресе грам оң микроорганизмдер сезімтал болып келеді.

Фибронектин - макрофагтар синтездейтін плазма және тін сүйықтығының белогы. Микроорганизмдердің фагоцит мембранасымен байланысуын қамтамасыз етеді.Сепсис кезінде плазмадағы фибронектин концентрациясы жылдам төмендейді.