Файл: Ферменты. Гидролазы_2000.doc

(8)

Таким образом, при высоких концентрациях субстрата скорость биохимической реакции становится максимальной и описывается уравнением нулевого порядка (рисунок 1).

V

n = 0

n = 1

S

участок кривой при n = 0 – уравнение реакции 0-го порядка;

участок кривой при n = 1 – уравнение реакции 1-го порядка.

Рисунок 2 – График зависимости скорости биохимической реакции (V) от концентрации субстрата S

Любые воздействия, приводящие к денатурации, т.е. нарушению третичной структуры, приводят к искажению или разрушению структуры активного центра и соответственно потере ферментом каталитических свойств.

Термолабильность, или чувствительность к повышению температуры, является одним из характерных свойств ферментов, резко отличающих их от неорганических катализаторов.

Температурный оптимум действия большинства ферментов животного происхождения составляет 37–50 С, а растительных 40–60 С. При нагревании свыше оптимальной температуры активность ферментов снижается и при 80 С большинство ферментов инактивируется вследствие денатурации. При низких температурах (0 С и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, хотя активность их падает.

Ферменты чувствительны к рН среды. Концентрация водородных ионов действует на активный центр ферментов, на степень его ионизации, а также на ионизацию субстрата и, следовательно, на формирование фермент–субстратного комплекса и скорость реакции. Для каждого фермента существует оптимальное значение рН. Незначительное отклонение рН от оптимального значения замедляет или прекращает действие ферментов.

Оптимальное значение рН для пепсина – 1,5–2,0; амилазы слюны – 6,8–7,0; амилазы солода – 4,4–4,5; липазы поджелудочной железы – 7,0–7,8.

Как видно из приведенных примеров, ферменты, катализирующие одни и те же реакции, но выделенные из разных объектов, могут иметь разный оптимум действия рН.

Принцип метода.Заключается в различной окраске раствора крахмала йодом, зависящей от степени его гидролиза амилазой при различных значениях температуры и рН среды.

Ход работы. Налить в 5 пробирок по 5 мл 0,1 %–ного раствора крахмала. В первые четыре налить по 1 мл дистиллированной воды, а в пятую – 1 мл 0,1 н. НСI. Первую пробирку ставят в лед или снег, вторую оставляют при комнатной температуре, третью и пятую помещают в термостат при 40С, а четвертую ставят в кипящую баню на 10–15 мин. Затем во все пробирки добавляют по 1 мл разбавленной слюны. Содержимое пробирок перемешивают и оставляют еще на 10–15 мин в тех же условиях. Нагретые пробирки охлаждают и во все добавляют 1–2 капли раствора Люголя. Отмечают окраску всех пробирок и делают вывод о действии температуры и рН на активность фермента.

---

3. Активирование и ингибирование ферментов

Активность ферментов в значительной степени определяется присутствием в среде активаторов и ингибиторов: первые повышают скорость реакции, а вторые тормозят эту реакцию. К числу активаторов относятся ионы многих металлов – Мg⁺², Мn⁺², Zn⁺², К⁺ и Со⁺² и некоторые анионы  СI^–, SH^–. Их действие объясняется, тем что они могут входить в состав простетической группы, облегчают образование фермент–субстратного комплекса, обеспечивают формирование четвертичной структуры, способствуют присоединению кофермента к апоферменту. Активаторы присоединяются к аллостерическому центру фермента и изменяют конформацию белка. В результате этого субстратный и каталитический центры фермента приобретают наиболее выгодную для осуществления своих функций пространственную конфигурацию.

Различают два типа ингибирования – необратимое и обратимое. При необратимом ингибировании ингибитор, обладающий структурным сходством с субстратом, подменяет собой субстрат, образуя прочный не распадающийся комплекс, в результате чего фермент выходит из строя. Ингибитор может быть и аналогом кофермента, способным занимать место настоящего кофермента, но не способным выполнять его функции. В обоих случаях необратимо блокируется активный центр фермента.

При конкурентном ингибировании ингибитор и субстрат имеют сходные структуры и конкурируют за связывание с активным центром фермента. Поскольку конкурентный ингибитор связывается обратимо с ферментом, то ослабить его действие можно, увеличивая концентрацию субстрата, т.к. при этом увеличивается вероятность связывания фермента с субстратом.

Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте (с регуляторным центром) молекулы фермента. При этом образуется тройной комплекс: фермент–ингибитор–субстрат, который не приводит к образованию продукта реакции. Такое ингибирование не может быть преодолено повышением концентрации субстрата.

Принцип метода. Заключается в различной окраске раствора крахмала йодом, зависящей от его гидролиза –амилазой в присутствии активатора или ингибитора.

Ход работы. В две пробирки наливают по 8 капель воды. В одну из них добавляют 2 капли 1 %–ного раствора сернокислой меди, в другую – 2 капли 1 %–ного раствора хлористого натрия. В обе пробирки добавляют по 10 капель раствора слюны, перемешивают и добавляют по 5 капель 0,2 %–ного раствора крахмала, вновь перемешивают и ставят в термостат на 10 минут. Затем во все пробирки по 2–3 капли раствора Люголя. По результатам опыта делают вывод.

---

Материалы и реактивы. Хлебопекарные дрожжи; 0,1 %–раствор крахмала; 1 %–ный раствор сахарозы; слюна разбавленная; 1 %–ный и 10 %–ный растворы едкого натра; 1 %–ный и 5 %–ный растворы сернокислой меди; раствор Люголя (cм. Приложение 1, п.1);0,1 н. раствор НСI.

Оборудование.Пробирки; пипетки на 1,2,5 мл;битое стекло; термостат; ступки с пестиками; воронка; коническая колба; водяная баня;

4. Гидролазы

Катализируют различные реакции гидролиза:

R_IR_II + HOH –––––> R_IH + R_IIOH

Значительная часть гидролаз представлена пищеварительными ферментами, с помощью которых полимеры, поступающие с пищей в организмы животных и человека, расщепляются до мономеров и реутилизируются для построения новых биополимеров по собственным наследственным программам.

Гидролиз полимеров помимо его значения для реутилизации важнейших мономеров, играет в живой природе еще две важные роли.

Во-первых, это уничтожение внутри клетки биополимеров, которые, выполнив свою функцию, становятся ненужными на последующем этапе жизнедеятельности. Известно, например, что у прокариот время жизни отдельных молекул мРНК невелико – выполнив свою функцию в производстве необходимых клетке белков, они гидролизуются до мономеров и повторно используются для создания новых молекул нуклеиновых кислот, необходимых для следующего этапа жизни.

Во-вторых, это осуществление так называемого процессинга белков и РНК. Многие белки и РНК синтезируются не в зрелом виде, а в виде предшественников, содержащих дополнительные фрагменты полипептидных и полинуклеотидных цепей. Эти фрагменты удаляются с помощью специальных гидролаз, и такая обработка предшественников с образованием зрелых молекул называется процессингом.

Гидролазы находят применение и в пищевых технологиях. В хлебопекарном и пивоваренном производствах используются амилазы для улучшения качества теста и осоложения крахмала. Протеиназы и целлюлазы оказываются полезными реагентами в виноделии и приготовлении соков. Протеиназы ускоряют процесс мягчения мяса, улучшающего консистенцию, а также применяются при производстве сыров.

---

1. Глюкозидазы

   1. Выделение– и– амилаз солода.

Амилазы гидролизуют различные соединения: амилозу, амилопектин, гликоген, олигосахариды и родственные им вещества, построенные из остатков –D–глюкопиранозы и содержащие в молекулах 1,4 –1,6 гликозидные связи.

Активные центры амилаз образованы радикалами гистидина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, а также тирозина. Последнему приписывают функцию связывания субстрата, а первым трем – каталитическую функцию. Предполагают следующий механизм распада гликозидных связей 1,4 – 1,6 при участии амилаз (см. рисунок 3 (I стадия)).

На второй стадии в активный центр фермента входит молекула воды, присоединения ОН групп, которой обеспечивает распад возникшей сложно–эфирной связи и высвобождение радикала дикарбоновой аминокислоты; протон воды присоединяется к депротонированному на 1–ой стадии радикалу гистидина (см. рисунок 4 (II стадия)).

В результате восстанавливается структура активного центра фермента, и он готов к осуществлению следующего каталитического акта в гидролизе гликозидной связи.

Рисунок 3 – Механизм действия амилаз (1-я стадия)

Рисунок 4 – Механизм действия амилаз (2-я стадия)

Предполагают, что не только амилазы, но и все другие гликозидазы действуют в соответствии с приведенным ниже механизмом.

Известны три вида амилаз, различающихся по распространению в природе, по ряду свойств и главным образом по конечным продуктам ферментативного действия.

–Амилаза (–1,4–глюкан–4–глюканогидролаза) – фермент гидролизует внут-ренние –1,4– глюкозидные связи в субстратах, приводя в конечном итоге к образованию мальтозы, некоторого количества глюкозы и различных низкомолекулярных олигосахаридов с разветвленной цепью.

–Амилаза (–1,4–глюканмальтогидролаза) и глюкоамилаза (–1,4–глюкан глюкогидролаза) в отличие от –амилазы гидролизуют наружные нередуцирующие концы цепей полисахаридов, последовательно отщепляя соответственно мальтозные и глюкозные остатки. Действие –амилазы и глюкоамилазы прекращается, как правило, вблизи первой точки ветвления полисахарида, образованного –1,6– глюкозидной связью. Поэтому, помимо мальтозы и глюкозы, под действием –амилаз и глюкоамилаз образуются декстрины (олигосахариды) высокой молекулярной массы.

---