Файл: Ферменты. Гидролазы_2000.doc

Материалы и реактивы.Ферментная вытяжка; растворимый крахмал,2 % раствор; фосфатный буфер,0,1 М раствор; сульфат меди,6 % раствор; Фелинг I – сульфат меди,4 % раствор; Фелинг II (см. Приложение 1,п.4); железоаммиачные квасцы (см. Приложение 1,п.5); перманганат калия, 0,1 н раствор.

Оборудование.Термостат; водяные бани; стеклянный фильтр; колбы Бунзена; плоскодонные колбы на 100 мл; бюретки; стеклянные палочки.

---

4. Определение активности амилолитических ферментов

Принцип метода. Основан на извлечении амилаз из растений раствором хлористого натрия, действии их на крахмал и определении колориметрическим путем негидролизованного крахмала.

Ход работы. Навеску муки 0,1–1 г (листьев или проростков – 5г) растирают с песком в фарфоровой ступке с 1%– ным раствором NaCl и переносят в стакан. Соотношение между навеской растительного материала и NaCl должно быть 1:10. Стакан с раствором ставят в холодильник на 1–1,5 ч, при этом содержимое периодически помешивают палочкой для выделения белков. Затем содержимое стакана переносят в центрифужные пробирки и встряхивают в течение 30 мин. После этого центрифугируют при 4–5 тыс. об/мин 10 мин. Полученную прозрачную жидкость используют в качестве ферментного препарата для определения активности амилаз.

Определение суммарной активности амилаз. В 2 сухие пробирки вносят по 3 мл 0,2 н. ацетатного буфера рН 5,5 и по 3 мл 2 %–ного раствора крахмала. Смесь нагревают до 40 С, приливают точно 0,2–0,4 мл ферментного препарата и перемешивают. В контрольную пробирку наливают 0,2–0,4 мл воды. Пробирки ставят в термостат при 40 С на 30 мин. За это время под действием амилаз крахмал гидролизуется. Закончив инкубацию, в каждую пробирку вносят по 2 мл 1 н. раствора НСl для прекращения действия фермента. Затем из каждой пробирки берут по 0,5 мл смеси и вносят в мерные колбы на 50 мл, в которые предварительно прилито 30–40 мл воды,1 мл 0,1н. НСl и 5 капель 0,3 %–ного раствора йода 3 %–ном растворе йодистого калия. Колбы доводят до метки водой, тщательно перемешивают и затем колориметрируют на спектрофотометре при 595 нм (на фотоэлектроколориметре при красном светофильтре).

Вычисление результатов проводят по формуле:

, (10)

где Е – активность амилазы в миллиграммах гидролизованного крахмала за 1 час 1 мл ферментного раствора

Dк – оптическая плотность контрольного раствора;

Dо – оптическая плотность опытного раствора;

С – количество внесенного крахмала (3 мл 2 % – ного раствора крахмала = 60 мг), мг.

Так как время инкубации составляло 30 мин, полученный результат умножают на 2, а количество взятого для анализа ферментного раствора приводят к 1 мл; необходимо учесть все разбавления). Для вычисления удельной активности определяют содержание белка в ферментном растворе (в миллиграммах) и полученную активность Е выражают в миллиграммах гидролизованного крахмала на 1мг белка за 1 ч (или за 1 мин).

---

Определение активности –амилазы. В оставшуюся часть фильтрата (5–8 мл) добавляют на кончике шпателя сухого уксуснокислого кальция и ставят на водяную баню при 70 С, выдерживают 15 мин, затем быстро охлаждают. –Амилаза при таких условиях инактивируется практически полностью. Далее этот раствор используют для определения –амилазной активности по методике, описанной выше.

Вычисление результатов активности –амилазы проводят так же, как и суммарной активности амилаз.

Активность –амилазы определяют по разности между суммарной активностью амилаз и активностью –амилазы.

Материалы и реактивы. 1 %–ный раствор NaCl; 0,2 н. ацетатный буфер рН 5,5; 2 %–растворимый крахмал (свежеприготовленный); 1 н НСl; 0,1 н НСl; 0,3 %–ный раствор йода в 3 %–ном растворе йодистого калия (см. Приложение 1, п. 2); уксуснокислый кальций (сухой).

Оборудование. Спектрофотометр или фотоэлектроколориметр, термостат, водяная баня, холодильник, центрифуга, стаканы, колбы мерные на 50 мл, градуированные пипетки, пробирки.

---

5. Определение активности амилазы (сывороточная амилаза крови)

Принцип метода. Показателем активности фермента является убыль крахмала, расщепляемого под действием сывороточной амилазы.

Для построения стандартной кривой в 5 мерных колбочек емкостью 50 мл наливают по 30–40 мл воды, переносят по 0,5; 1.0; 2,0; 3,0; 4,0 мл раствора крахмала, добавляют по 0,5 мл раствора соляной кислоты, по 0,1 мл раствора йода, доводят водой до метки и перемешивают. Колориметрируют через 5 мин на ФЭКе с красным светофильтром относительно воды в кюветах с расстоянием 1 см между рабочими гранями.

Ход работы. В 2 центрифужные пробирки наливают по 0,5 смеси растворов крахмала и хлорида натрия и по 0,3 мл фосфатной буферной смеси. В пробирку 1 (опыт) добавляют 0,1 мл сыворотки крови, в пробирку 2 (контроль) – 0,1 мл дистиллированной воды. Обе пробирки инкубируются в термостате (37 С) в течение 30 мин. Затем в обе пробирки добавляют по 0,1 мл 1 н. раствора соляной кислоты и центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин. В мерные колбы (50 мл) наливают по 30–40 мл воды, переносят по 0,2 мл центрифугата и проводят цветную реакцию, как это описано для построения стандартной кривой.

Активность амилазы (Е) выражают количеством крахмала (мг), которое может расщепить за 30 мин фермент, содержащийся в 100 мл сыворотки. Расчет ведут по формуле:

, (11)

где Е – активность амилазы;

а – количество крахмала в опытной пробирке, найденное по стандартной кривой, мг;

b – количество крахмала в контрольной пробирке, найденное по стандартной кривой, мг;

100 – пересчет на 100 мл сыворотки;

0,1 –количество сыворотки, взятое для исследования, мл;

0,2 – количество центрифугата , взятое для цветной реакции, мл.

Материалы и реактивы. 1 %–ный раствор крахмала; 0,5 М раствор хлорида натрия; смесь 1 %–ного раствора крахмала с 0,5 М раствором хлорида натрия (4:1); фосфатный буфер, рН 7,2; сыворотка крови свежая без признаков гемолиза; 1 н. раствор соляной кислоты; 0,3 %–ный раствор йода в 3 %–ном растворе иодистого калия (см. Приложение 1, п. 2).

Оборудование. Штатив с центрифужными пробирками; пипетки; микропипетки (0,1 мл); термостат (37 С); центрифуга; мерные колбы (50 мл); фотоэлектроколориметр.

---

2. Протеазы

Протеазы или протеолитические ферменты – это группа ферментов, относящаяся к классу гидролаз и подклассу пептид–гидролаз.

Пептид–гидролазы – ускоряют гидролиз пептидных связей в белках и пептидах.

В зависимости от характера действия протеазы делятся на протеиназы и пептидазы.

Протеиназы катализируют гидролиз небольшого числа внутренних пептидных связей в белковой молекуле (эндопептидазы), с образованием пептидов.

Пептидазы катализируют гидролиз пептидных связей в пептидах с образованием свободных аминокислот (экзопептидазы). Пептидазы могут отщеплять от пептида аминокислоту, имеющую свободную аминогруппу (NН₂) – это аминопептидазы, либо аминокислоту, имеющую свободную карбоксильную группу (СООН) –карбоксипептидазы.

Очень важной особенностью протеаз является выборочный (селективный) характер их действия на пептидные связи в белковой молекуле. Так, пепсин избирательно ускоряет гидролиз пептидных связей, образованных аминокислотами Фен и Лей; трипсин – Арг и Лиз; химотрипсин – ароматическими аминокислотами Фен, Трп, Тир; папаин – Арг, Лиз, Фен и т. д. (см. рисунок5)

Причина избирательного действия пептид–гидролаз заключается в том, что радикал аминокислоты, по соседству с которым гидролизуется пептидная связь, служит для образования фермент–субстратного комплекса.

Механизм действия пептидгидролаз рассмотрен на примере действия химотрипсина (см. рисунок 6).

Фрагменты единой полипептидной цепи молекулы фермента условно показаны слева и справа изогнутой линией, в их составе отмечены остатки сер и гис с их функциональными группами. В активном центре фермента точно против остатков сер и гис размещается пептидная связь гидролизуемого белка, образованная остатком фен (или

1 – лейцинаминопептидаза

2 – пепсин

3 – трипсин

4 – химотрипсин

5 – карбоксипептидаза А

Рисунок 5 – Точки приложения действия протеолитических ферментов на пептидные связи в белковой молекуле

Рисунок 6 – Упрощенная схема гидролиза пептидной связи в активном центре химотрипсина

---