Файл: 696.pdf

сульфидных руд. Фотолитоавтотрофы и хемолитоавтотрофы растут на доступных питательных неорганических средах, однако применение их ограничено, они не способны продуцировать полезные продукты, кроме биомассы и ограниченного ряда веществ. Большинство продуцентов важнейших биотехнологических продуктов являются хемоорганогетеротрофами, т.е. способны расти на сложных органических питательных средах. Многие из них используют в качестве источника углерода и энергии сахара, органические кислоты, спирты и др. Такие питательные среды дороги, поэтому в биотехнологии часто используются отходы пищевой, целлюлозо-бумажной и других отраслей промышленности, а также сельского хозяйства.

3.2. ВИРУСЫ

Вирусы – образующиеся биологическим путем надмолекулярные комплексы, способные к самовоспроизведению в клетках-хозяевах. Вирусы – облигатные паразиты. Их воспроизведение возможно только в клетках-хозяевах. Вне клеток вирусы (вирионы) являются неживыми, имеют правильную форму (Рис.), состоят из молекулы нуклеиновой кислоты (или ДНК, или РНК) и окружающей ее белковой оболочки – капсида. Вирусы специфичны в отношении хозяев. По природе клетки-хозяина вирусы делят на вирусы бактерий – бактериофаги (ДНК, РНК); вирусы растений (РНК); вирусы животных и человека (ДНК, РНК) (Рис.3,4). Внутри клетки вирусная частица становится внутриклеточным паразитом

Рис.3. Форма и величина вирионов некоторых вирусов.

12

видам микроорганизмам требуются различные составы питательных веществ.

Рис.30. Принципиальная схема биотехнологического процесса.

По составу питательные среды подразделяются на 2 группы - натуральные и синтетические.

Натуральными называются среды, которые состоят из натуральных пищевых продуктов (молоко, яйца, мясо). Большинство из них применяют в виде экстрактов или настоев. Эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав. Они используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей. Примерами служат мясопептонный бульон, почвенная вытяжка, картофельная среда. Среди натуральных сред широкое применение нашли: меласса – отход свеклосахарного производства, применяется как основной источник углерода, кукурузный экстракт, отруби и др.

Синтетические среды - это среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Для разработки синтетических сред необходимо знать

81

По характеру взаимодействия бактериофага с клеткой все бактериофаги делятся: на вирулентные (литические), вызывающие продуктивную инфекцию и лизис бактериальной клетки и умеренные (лизогенные), вызывающие латентную инфекцию и ассоциацию генома вируса с бактериальной хромосомой (Рис.5). Умеренные фаги, в отличие от вирулентных, не вызывают гибели бактериальных клеток и при взаимодействии с ними переходят в неинфекционную форму фага, называемую профагом. Профаг – геном фага, ассоциированный с бактериальной хромосомой. Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении реплицируется синхронно с геномом бактерии, не вызывая ее лизиса, и передается по наследству от клетки к клетке в неограниченном числе поколений.

Рис.4. Модель бактериофага Т2. А. Фаг с вытянутым чехлом до адсорбции. Б. Фаг с сократившимся чехлом после адсорбции и инъекции.

Бактериальные клетки, содержащие в своей хромосоме профаг, называются лизогенными. Профаг в лизогенных бактериях самопроизвольно или под влиянием различных индуцированных агентов может переходить в вегетативный фаг. В результате такого превращения

14

этапе – предферментационном (Рис.30) – готовят питательную среду для культивирования продуцента, стерилизуют ее для полного удаления жизнеспособной посторонней микрофлоры, получают инокулят – посевную дозу продуцента, моют и стерилизуют оборудование для культивирования.

Основная стадия биотехнологического производства

– стадия культивирования продуцента или ферментации (биотрансформации) (Рис.30). На этой стадии происходит рост продуцента и биосинтез целевых продуктов. Используют разные технологии культивирования – в жидкой питательной среде (глубинное культивирование) и на твердой питательной среде (поверхностное культивирование). Основным продуктом стадии глубинной ферментации является культуральная жидкость – суспензия клеток продуцента в питательной среде, содержащей растворимые продукты метаболизма (метаболизм - обмен веществ, химические превращения, протекающие от момента поступления питательных веществ в живой организм до момента, когда конечные продукты этих превращений выделяются во внешнюю среду). Целевой продукт может содержаться как в клетках (биомассе), так и в растворе (внеклеточные продукты). Этими вариантами определяется схема выделения и очистки продукта. Приведенная на Рис.30 схема иллюстрирует биотехнологический процесс.

Рассмотрим отдельные стадии биотехнологического процесса. Предферментационный этап складывается из следующих этапов:

1.Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними.

2.Приготовление посевной микробной культуры.

3.Приготовление и стерилизация питательных сред.

4.Подготовка биореактора к посеву.

79

2.Отделение биомассы (клеток продуцента) методом центрифугирования;

3.Разрушение клеток с выделением телец включения;

4.Очистка рекомбинантного белка.

Тельца включения

Рис.29. Микрофотография клеток Е. coli с тельцами включения.

Начиная с 1982 года фирмы США, Японии, Великобритании и других стран производят генноинженерный инсулин на основе различных современных модификаций генно-инженерного метода. Из 1000 литров бактериальной культуры получают приблизительно 200 г инсулина, что равно количеству, получаемому из 1600 кг поджелудочной железы животных. Параллельно была решена проблема иммунологического поражения организмов диабетиков животным инсулином.

Производство и продажу инсулина впервые начала американская фирма Eli Lilly (США). Мировой рынок инсулина составляет в настоящее время более 400 млн. долларов, ежегодное потребление около 5000 кг.

5. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА

В биотехнологии биологические объекты (продуценты) выращивают в условиях, оптимальных для биосинтеза целевых продуктов – культивируют. На первом

78

бактериальная клетка лизирует и продуцирует новые фаговые частицы. В ходе лизогенизации бактериальные клетки могут дополнительно приобретать новые признаки, детерминируемые геномом вируса. Такое явление – изменение свойств микроорганизмов под влиянием профага — называется фаговой, или лизогенной, конверсией (проявление вирус-индуцироанной трансформации).

Исключение фаговой ДНК из бактериальной хромосомы под действием, например мутагенов, приводит к переходу в литический цикл и репродукции фаговых частиц.

Рис.5. Жизненные циклы умеренного фага (на примере фага E.coli): включение ДНК фага в ДНК хозяина и исключение, приводящее к лизису клетки.

Умеренные фаги, неспособные ни при каких условиях переходить из профага в вегетативный фаг (образовывать зрелые фаговые частицы), называются дефектными, чаще это происходит в результате нарушения

15

стадии сборки вирусных частиц. Некоторые умеренные фаги называются трансдуцирующими, поскольку с их помощью осуществляется один из механизмов генетической рекомбинации у бактерий – трансдукции. Такие фаги могут использоваться, в частности, в генной инженерии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК и/или приготовлении рекомбинантных (генно-инженерных) вакцин.

Наиболее широко вирусы применяют в вакцинном производстве и в генетической инженерии, где они используются в качестве векторов для внесения чужеродной ДНК, несущей нужный ген, в клетку-хозяина.

Фаги могут применяться в качестве диагностических препаратов для установления рода и вида бактерий, выделенных в ходе бактериологического исследования больных людей. Однако чаще всего их используют для лечения и профилактики некоторых инфекционных заболеваний. Лечебное и профилактическое действие фагов основано на их литической активности.

Отличительной чертой бактериофагов как терапевтических средств является почти полное отсутствие

уних побочного действия. В настоящее время

стрептококковый, коли-фаг (кишечной палочки) и др.

3.3. БАКТЕРИИ

Бактерии являются важнейшими продуцентами в биотехнологии. Рассмотрение их будет более подробным. Все бактерии делятся на две группы – эубактерии (собственно бактерии) и архебактерии, имеющие по некоторым данным более раннее происхождение, чем эубактерии. Для большинства архебактерий характерна способность расти в экстремальных условиях – при высоких температурах, низких значениях рН,

16

Рис.28. Биосинтез инсулина крысы в сконструированных клетках E. coli: а) карта плазмиды pBR322; б) карта, полученная при определении последовательности рДНК рекомбинантной плазмиды в продуцирующем инсулин клоне E. coli; в) гибридный белок; г) биологически активный инсулин после удаления пенициллиназы и сегмента проинсулина.

Рекомбинантный белок синтезировался бактериями внутриклеточно в виде так называемых телец включения (inclusion bodies), которые представляют собой агрегаты целевого белка в денатурированном неактивном состоянии (Рис.29). Благодаря этому целевой белок, находясь в нерастворимом состоянии, не подвергается протеолизу цитоплазматическими ферментами.

Процесс получения инсулина включал следующие стадии (подробнее см. раздел):

1.Ферментация (выращивание штамма-продуцента в ферментере);

77

первыми были выбраны бактерии E. coli, которые имеют как преимущества, так и недостатки (Табл.7).

Таблица 7 Преимущества и недостатки Esherichia coli в качестве

системы экспрессии эукариотических генов

В результате трансляции мРНК в клетках синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина, который выщепляли из такого белка трипсином (Рис.28).

76

концентрированных растворах соли. Ряд биохимических свойств сближает архебактерии с эукариотами, есть у них и уникальные свойства, поэтому архебактерии выделены в отдельную группу.

3.3.1. Таксономия бактерий

Бактерии имеют клеточное строение (Рис.6), размер клеток в среднем 1×5 мкм. В цитоплазме (клеточное пространство, заполненное водным раствором – цитозолем) находится зона нуклеоида, состоящая на 80% из ДНК, 20% приходится на белки и РНК. Наследственная информация в бактериальной клетке содержится в кольцевой молекуле ДНК – единственной хромосоме, которая не окружена мембраной, т.е. ядро отсутствует. В клетках присутствуют небольшие кольцевые молекулы нехромосомной ДНК – плазмиды, несущие необязательную для выживания клетки информацию. Чаще это гены устойчивости к антибиотикам или способности использовать определенные субстраты. Плазмиды реплицируются автономно от хромосомы.

Рис.6. Схема строения бактериальной клетки.

17

Цитоплазма окружена важнейшей клеточной структурой – цитоплазматической мембраной, представляющей собой двойной слой липидов, в который погружены интегральные белки (в область одного липидного слоя), периферические белки примыкают к поверхности мембраны, трансмембранные белки пронизывают бислой (Рис.7). Функции цитоплазматической мембраны – транспорт питательных веществ внутрь клетки и продуктов метаболизма наружу, а также получение энергии в виде АТФ. Цитоплазматическая мембрана вместе с цитоплазмой называется протопластом.

В цитоплазме находятся рибосомы – комплексы рибосомальной РНК и белка – на рибосомах происходит биосинтез белка на матрице матричной РНК. В клетках бактерии могут присутствовать включения запасных веществ, выросты цитоплазматической мембраны.

Рис.7. Жидко-мозаичная модель строения плазматической мембраны.

Структуры, расположенные снаружи цитоплазматической мембраны, называются поверхностными структурами. К поверхностным структурам относятся клеточная стенка, капсула, чехол, жгутики, ворсинки (Рис.6). Важнейшим компонентом

18

остатка аланина на остаток треонина. В результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99 % чистоты. Ограничения использования этого метода связаны с ограниченностью сырьевой базы - поджелудочной железы телят и свиней, поскольку для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 8001000 кг исходного сырья.

Рис.27. Структура инсулина человека: А) структура проинсулина; Б) третичная структура инсулина.

Поскольку известна структура инсулина, можно рассматривать синтетический метод получения инсулина. Синтез обеих цепей, включающий 170 химических реакций, в 1963 г. был реализован в США, ФРГ и Китае. Но перенести такой сложный процесс в промышленность оказалось невозможным.

В 1980 г. У.Гилберт с сотрудниками выделили мРНК инсулина из опухоли β-клеток поджелудочной железы крысы и с помощью обратной транскриптазы получили рДНК (см. раздел ). Полученную рДНК встроили в плазмиду pBR322 Е. coli, в среднюю часть гена пенициллиназы (см. раздел 4.2.2.1). Рекомбинантная плазмида содержала информацию о структуре проинсулина. В генетической инженерии в качестве системы экспрессии эукариотических генов используют бактерии Esherichia coli и Bacillus subtilis, дрожжи Saccharomyces cerevisae и Pichia pastoris, линии клеток млекопитающих, трансгенные животные. Исторически

75