Файл: 696.pdf

одноцепочечного предшественника — препроинсулина, содержащего концевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигнального пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислотных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С- пептидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при замыкании дисульфидных связей (Рис.). После протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин.

Рис.26. Первичная структура инсулина человека. Первичная структура инсулина у разных

биологических видов несколько различается, как различается и его важность в регуляции обмена углеводов. Наиболее близким к человеческому является инсулин свиньи, который различается с ним всего одним аминокислотным остатком: в 30 положении B-цепи свиного инсулина расположен аланин, а в инсулине человека — треонин; бычий инсулин отличается тремя аминокислотными остатками. Первые лекарственные препараты инсулина были на основе животного инсулина, однако такие препараты вызывали у больных аллергические реакции и другие побочные эффекты. В 1972 г. был разработан метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека ферментативным замещением

74

стадии сборки вирусных частиц. Некоторые умеренные фаги называются трансдуцирующими, поскольку с их помощью осуществляется один из механизмов генетической рекомбинации у бактерий – трансдукции. Такие фаги могут использоваться, в частности, в генной инженерии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК и/или приготовлении рекомбинантных (генно-инженерных) вакцин.

Наиболее широко вирусы применяют в вакцинном производстве и в генетической инженерии, где они используются в качестве векторов для внесения чужеродной ДНК, несущей нужный ген, в клетку-хозяина.

Фаги могут применяться в качестве диагностических препаратов для установления рода и вида бактерий, выделенных в ходе бактериологического исследования больных людей. Однако чаще всего их используют для лечения и профилактики некоторых инфекционных заболеваний. Лечебное и профилактическое действие фагов основано на их литической активности.

Отличительной чертой бактериофагов как терапевтических средств является почти полное отсутствие

уних побочного действия. В настоящее время

стрептококковый, коли-фаг (кишечной палочки) и др.

3.3. БАКТЕРИИ

Бактерии являются важнейшими продуцентами в биотехнологии. Рассмотрение их будет более подробным. Все бактерии делятся на две группы – эубактерии (собственно бактерии) и архебактерии, имеющие по некоторым данным более раннее происхождение, чем эубактерии. Для большинства архебактерий характерна способность расти в экстремальных условиях – при высоких температурах, низких значениях рН,

16

L-аланина, D-глутаминовой кислоты, L-лизина или мезо- (или LL-)диаминопимелиновая кислоты и D-аланина. Диаминокислоты играют важную роль в межмолекулярных сшивках, так как образуют пептидные связи с участием обеих аминогрупп. Тетрапептидные боковые связи всех дисахаридных единиц связаны с соседними цепями при помощи поперечных пентапептидных мостиков из глицина. Таким образом образуется гигантская мешкообразная молекула – муреиновый мешок.

Рис.8. Строение клеточной стенки грамположительных (А) и грамотрицательных бактерий (Б). 1 – цитоплазматическая мембрана, 2 – пептидогликан, 3 – периплазматическое пространство, 4 – наружная мембрана, 5 – цитоплазма (в центре ДНК).

Для быстрой идентификации бактерий используют Определитель бактерий Берги, выпускаемого периодически Обществом американских бактериологов с привлечением крупных специалистов в области изучения тех или иных групп бактерий. Первое издание Определителя было выпущено в 1923 г. группой американских бактериологов под руководством Д.X. Берги (D.H. Bergey, 1860-1937), девятое издание в 4 томах вышло в 1984-1989 гг. Признаки, по которым осуществляется разделение на группы, следующие:

- морфологические (форма клетки (Рис.9), наличие или отсутствие жгутиков, капсулы, способность к

20

несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину, а клетки, получившие интактную плазмиду pBR322, несут ген tet и устойчивы как к ампициллину, так и к тетрациклину.

На втором этапе проводят разделение этих двух вариантов. Клетки, выросшие на среде с ампициллином, переносят на среду с тетрациклином методом перепечатки

(Рис.25).

Рис.25. Перенос клеток со среды с ампициллином на среду с тетрациклином методом перепечатки.

Клетки, не выросшие на чашках с тетрациклином, чувствительны к этому антибиотику, значит, они содержат гибридную плазмиду pBR322. Среди колоний, выросших на среде с ампициллином, выделяют те, которые оказались чувствительны к тетрациклину, и из каждой колонии получают индивидуальные клеточные клоны или (чаще делают именно так) объединяют все колонии, устойчивые к ампициллину и чувствительные к тетрациклину, и культивируют их вместе.

4.2.3. Получение рекомбинантного инсулина

Инсулин — гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Дефицит этого гормона в организме приводит к сахарному диабету. Инсулин — небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде

73

Метод микроинъекции используют в случаях механического введения ДНК (в том числе рДНК) в ядра культивируемых клеток млекопитающих, растений, используя для этого стеклянные микроиглы с диаметром отверстия 0,1-0,5 мкм. В некоторых случаях применяют упаковку рекомбинантной ДНК в липосомы (полые частицы, содержимое которых ограничено липидной мембраной). Заключенные в липосомы ДНК защищены от нуклеаз, легко проникают в клетки в результате слияния липосом и мембраны клеток или при поглощении их путем фагоцитоза.

Электропорация – перенос генетического материала через мембранные поры, образующиеся в результате воздействия на клетку высоковольтного импульса (350 В, 54 мс).

Для трансформации растительных клеток используют бомбардировку микрочастицами золота или вольфрама с адсорбированным на них генетическим материалом. Частицам сообщается кинетическая энергия, достаточная для прохождения через клеточные стенки.

4.2.2.4. Идентификация и отбор клеток, которые приобрели нужный ген

В системе pBR322, в которой чужеродная ДНК встраивается в сайт BamHI (в гене tet, см. Рис.18), специфическая идентификация состоит из двух этапов. Сначала клетки после трансформации высевают на питательную среду, содержащую ампициллин. В таких условиях могут вырасти только те клетки, в которых присутствует интактный ген bla - или в составе интактной плазмиды pBR322, или в составе гибридной плазмиды; нетрансформированные клетки чувствительны к ампициллину. Сайт BamHI расположен в гене tet плазмиды pBR322, встраивание в этот ген фрагмента ДНК прерывает кодирующую последовательность, и устойчивость к тетрациклину утрачивается. Таким образом, клетки,

72

спорообразованию, особенности внутриклеточного строения, окрашивание по Граму);

-культуральные (признаки, выявляемые при культивировании в лаборатории чистой культуры бактерии);

-физиолого-биохимические (способы получения энергии, потребности в питательных веществах, отношение к факторам внешней среды, нуклеотидный состав и последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК, наличие и характер минорных оснований в ДНК, нуклеотидный состав рибосомальной РНК, последовательность аминокислот в ферментных белках с аналогичными функциями).

Рис.9. Формы бактерий.

А – микрококки, б – стрептококки, в – сарцины, г – диплококки и тетракокки, д – стафилококки, е – палочки, ж

–спороносные палочки.

Вдевятом издании Определителя бактерий Берги все обнаруженные организмы, отнесенные к царству бактерий, разделены на 35 групп, относящихся к 4 секциям

–1) Грамотрицательные бактерии, имеющие клеточную стенку (Gracilicutes); 2) Грамположительные бактерии, имеющие клеточную стенку (Firmicutes); 3) Эубактерии, не

21

имеющие клеточной стенки (Tenericutes); 4) Архебактерии

(Mendosicutes).

Представленная в Определителе бактерий Берги система классификации является строго идентификационной и не решает задачи выявления эволюционных связей между прокариотами. Для установления степени родства между прокариотными организмами разработаны методические подходы, позволяющие сравнивать продукты отдельных генов, выполняющие в клетке одинаковые функции. Общепринятой мерой эволюционного расстояния между организмами служит количество нуклеотидных замен в молекулах сравниваемых рРНК. Наиболее удобным оказался анализ молекул рРНК средней величины: 16S (у прокариот) и 18S (у эукариот), состоящих из 1600 и 2500 нуклеотидов соответственно. Как показал анализ нуклеотидного состава 16S рРНК, эволюция живых организмов протекала от прокариот к эукариотам, причем эубактерии и архебактерии – отдельные ветви эволюции

(Рис.10).

3.3.2. Генетическая изменчивость бактерий

Бактерии размножаются бинарным делением, которому предшествует репликация (удвоение) бактериальной хромосомы. В результате образуются две одинаковые дочерние клетки. При этом дочерние клетки являются полными копиями родительской клетки. Как же осуществляется процесс эволюции у бактерий, ведь меняющиеся условия среды диктуют необходимость изменений и адаптации для сохранения жизнеспособности. Такие изменения могут быть результатом мутаций (мутация – стойкое (то есть такое, которое может быть унаследовано потомками данной клетки или организма) изменение генотипа, происходящие под влиянием внешней или внутренней среды.

22

рекомбинантную плазмиду и чужеродный ген. Ген клонирован в бактериальной клетке и индуцирует в ней синтез белка.

Для клонирования ДНК используют так называемые пермиссивные клетки (от англ. Permission – разрешение). Особенности пермиссивных клеток:

1.Внутриклеточные нуклеазы не разрушают включаемую ДНК или РНК.

2.Вектор способен реплицироваться в пермиссивной клетке.

3.Выраженная активность промотора и/или терминатора транскрипции рДНК.

4.Сплайсинг РНК.

5.Наблюдается эффективная трансляция мРНК.

6.Нет выраженной активности пептидогидролаз, катализирующих гидролиз экспрессируемых чужеродных белков.

Для включения рДНК в пермиссивные клетки пользуются методами трансформации, инфекции, микроинъекций, электропорации. Ввод рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина называется трансформацией. Для ее осуществления используют специально разработанные приемы, например, обрабатывают клетки бактерий полиэтиленгликолем или хлористым кальцием на холоду. Обработанные таким образом клетки бактерий, подготовленные к трансформации, называются компетентными. Однако эффективность трансформации все же остается невысокой, обычно трансформируется не более одной клетки из тысячи. Таким образом, большинство клеток после проведения трансформации не содержат рекомбинантной ДНК.

Перенос рДНК в клетки прокариот или введение последовательностей клонированной ДНК в рецепторные эукариотические клетки (например, млекопитающих) с помощью фаговых векторов называют трансфекцией.

71