ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 22.03.2019
Просмотров: 891
Скачиваний: 3
l i c i t « t e n
H R K jW n p t IN N INNN,
I f l m i K I n p n i A i r H U f N N t I I N U i r i K N W ! I f f I
Бактериологические исследования связаны с использованием цитате
которые предназначены для выращивания микроорганизмов как в лаборатор^НЫ* «Ред,
промышленных условиях
,а* и „
Питательные среды необходимы для выделения, накопления, сохранени
культуральных и биохимических свойств микроорганизмов. Они должны в к л к !,.^ 4 ^
все компоненты
Назначение
и
классификация питательных
сред
необходимые для конструктивных и энергетически^4*-1' Вм*>*
бактериальной
клетки, г с должны иметь источники углерода, азота, кислороЛа
макро- и микроэлементы, «факторы роста» (витамины)
Пр<)ц*со.
ВОд°рОда
Метаболизм
микроорганизмов
разнообразен,
следовательно, раз
потребности в источниках питания. Отсюда следует, что универсальных питатель^ Их
одинаково пригодных для культивирования всех видов микроорганизмов, не cy iJ!?* Срс'1
Вместе с тем можно сформулировать следующие требования, предЪяв ГВует
питательным средам:
• питательные
среды
должны
содержать
все
питательные
^
обеспечивающие оптимальный рост микроорганизмов в искусственных условиях Шестна-
• в физико-химическом отношении они должны иметь определенную концентт,
водородных ионов (pH), окислительно-восстановительный потенциал, влажность, вязкой
и изотоничность;
• питательные среды должны быть стерильными и по возможности прозрачными
По составу среды для культивирования микроорганизмов делятся на две группы
натуральные (естественные) и синтетические.
В состав естественных сред входят компоненты растительного и животного
происхождения: овощные, фруктовые соки, молоко, кровь, экстракты из мяса и т. д. Из этой
группы широко применяются — мясопептонный бульон (М ПБ), мясопептонный агар
(МПА).
Синтетическими называют среды, в состав которых входят определенные
химические соединения, растворенные в дистиллированной воде. В настоящее время
микробиологи располагают синтетическими средами, не уступающими по своему состав\
натуральным.
По назначению питательные среды
разделяются
на обычные (простые),
специальные, дифференциально-диагностические, элективные (избирательные).
К обычным средам относятся мясопептонный бульон и агар, на них растут многие
виды микроорганизмов.
При отсутствии роста микробов на простых средах применяются специальные
среды, в состав которых входят углеводы, сыворотка крови, кровь, асцит и др.
Дифференциально-диагностические среды позволяют достаточно быстро отличить
одну группу бактерий от другой. К ним относятся среды для изучения сахаролитических,
протеолитических свойств и др
Злективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы
микроорг анизмов и менее пригодны или со всем не пригодны для развития других В состав
них сред входят химические компоненты, которые задерживают развитие определенных
групп микроорганизмов (желчь, краски, антибиотики, азид натрия и др ).
По физическому составу различают жидкие, полужидкие, плотные, сухие «.риы
Жидкие применяются для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроор
ганигмов. для накопления биомассы пли продуктов обмена; плотные — для выделения
чис
1
мх культур (получение изолированных колоний), для хранения культур, колик,
ственного учета микроор! анизмои и г л
llp in ОМЖ.
1
СН
11
С пит а и л ь н ы х сред
I,
в
[
Обычные питательные среды
Основой л Г п Г
МЯС0ПеГ" 0ННЫЙ бу' 1Ьон (МПБ) и мясо-пептонный агар (МПА).
500 г
' Р
,ТИХ Срел СЛУЖИ1 МЯСИ0Й буя“ н д™ его приготовления берут
ппопоГя
Т "
Г ”™ " ”' осв°божденной от костей, жира и сухожилий,
4epei МЯСОр5,бку' фарш )аливают I в водопроводной воды, хорошо ратмеши-
м
? <™ ВЛЯЮ1 на =У™ в прохладном месте или помещают на 2 ч в термостат при 37%
Мясной бульон отжимают через марлю. Кипятят в течение 60 мин для сверт ывания белков,
дают остыть,
ильтруюг через ватный фильтр, доливают водой до первоначального объема.
Приготовленный мясной бульон разливают по флаконам и 20-30 мин стерилизуют в
автоклаве 11равильно приготовленный мясной бульон представляет собой слабокислую (pH
- 6,2) прозрачную желтоватую жидкость без белков. В ней содержится большое количество
аминокислот, солей, углеводов, факторов роста и экстрактивных веществ.
Мясопептонный бульон (МПБ)
— жидкая питательная среда, прозрачная. В 1 л
мясного экстракта растворяют при подогревании и помешивании 10 г пептона (1%) и 5 г
(0,5% ) поваренной соли. Устанавливают pH среды 7,6. Кипятят 30-45 мин для выпадения
осадка.
Охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, заливают водой до
первоначального объема, проверяют pH. Разливают по пробиркам, флаконам и
стерилизуют 15-20 мин в автоклаве при давлении 1 атм.
Пептон представляет собой первичные продукты гидролизата белка. Он состоит из
смеси альбумоз, полипептидов и аминокислот, полученных путем пепсинно-трипсинного
гидролиза На мясокомбинатах для производства сухого пептона используют фибрин, кровь
и другие отходы. Сушат пептон в распылительной вакуум-сушилке.
М ясопепт онный а га р (МПА)
— плотная питательная среда. Для его приготовления
к мясопептонному бульону добавляют 2-3% агар-агара, расплавляют в водяной бане,
фильтруют, разливают по колбам или пробиркам и стерилизуют в автоклаве при давлении
1 атм 15-20 мин.
Для приготовления «скошенного» МПА среда, разлитая до 1/4 высоты пробирки,
вновь расплавляется и помещается на наклонную плоскость.
Для уплотнения сред чаше всего используют агар-агар, который представляет собой
полисахарид, получаемый из красных морских водорослей. Большинство микроорганизмов
не используют его в качестве питательного субстрата. В воде агар образует гели,
плавящиеся при 100°С. а затвердевающие при 40°С.
М ясопепт онны й ж ел ат и н (МПЖ)
— к мясопептонному бульону добавляют 10-15%
мелко нарезанного желатина, после набухания его нагревают до полного расплавления.
Устанавливают pH 7-7,1 и стерилизуют текучим паром 3 дня пбЬряд по 30 мин. Для
обнаружения протео-литических свойств культуру бактерий сеют уколом в столбик
желатина, посевы оставляют на несколько дней при комнатной температуре для учета
характера разжижения.
Желатин представляет собой белок, который получают путем выварки костей,
хрящей и др
С п е ц и а л ь н ы е ср ед ы
С а х ар н ы й М П Б и М П А .
К обычным средам добавляют 1-2% глюкозы, разливают по
пробиркам и стерилизуют текучим паром дробно или автоклавируют при 0.5 атм _0 мин.
( 'ы ворот оч н ы й МП Б и МПА
. К М ПБ добавляют 5 - 10% стерильном сыворотки крови
и разливают но пробиркам. МПА расплавляют, остужают до 4 > 5 0 ( и до авляют .
»
сыворотки крови. Г 1олученную среду разливают в чашки Пет эи или пробирки.
Р С верн ут ая сы вор от к а.
Сыворотку разливают по пробиркам (4-л мл) Аппарат
К о х а
и в наклонном положении свертывают в аппарате Кокк. Свертывание проводят при
ад °С в течение полутора часов. Среду контролируют на стерильность в термостате
3
Кровяной МПА
К стерильному расплавленному и охлажденному
omv
в пробирки или чашки 11етри, стерильно прибавляют 5-10% д е ф ^
разлитому в пробирка
крови (кролика.барана)
ной
Д и ф ф ер ен ц и ал ьн о-ди агн ост и ч еск и е среды
Ж идкие ср ед ы Гисса.
Для их приготовления используется 1% -ная
(pH * 7) с 0,5% соответствующего углевода и
индикатора (бромтимолблау
д ГП° ИНая во^
Улавливание
газа производится путем помещения
на
дно пробирки поплавков?***1 и *Р).
трубок), запаянных с одного (верхнего) конца.
СТеклянмЫх
Для улавливания пузырьков газа можно также к жидкой среде Гисса лоб
агар-агара. Стерилизуют среды Гисса при 1 10°С в течение 10 мин или текучи'ЙИ1 ь° 5%
учение 30 мин 3 дня подряд.
'
м ПаРом в
В настоящее время среды с углеводами выпускают в сухом виде <Ь г
способом. Они состоят из питательного агара, соответствующего углевода и инликаГ4”1*4
(смесь водного голубого красителя с розоловой кислотой). Для приготовления полу.°paftp
среды 2 г сухой среды растворяют при подогревании в 100 мл дистиллированной*”™0*
доводят до кипения, разливают в стерильные пробирки и стерилизуют 10 мин приТр*'**
или дробно. Среда имеет цвет питательного агара.
При ферментации углеводов с образованием кислоты наблюдается посинение среды
с образованием щелочи— покраснение.
Для выделения чистой культуры возбудителей кишечных болезней и их
дифференциации с Е. coli длительное время использовались среды Эндо и Левина, в
настоящее время применяется главным образом среда Плоскирева.
С р е д а Эндо.
Она выпускается в сухом виде и готовится следующим образом. 5 г
порошка растворяют при подогревании в 100 мл дистиллированной воды, кипятят 2-3 мин
при постоянном помешивании и разливают в чашки.
При отсутствии сухой среды Эндо она может быть приготовлена ex tempore. К 100
мл стерильного расплавленного МПА добавляют 1 г лактозы, растворенной и прокипя
ченной в 5 мл дистиллированной воды, и 1 мл насыщенного спиртового раствора основного
фуксина, обесцвеченного перед добавлением к агару 10% -ным водным раствором сульфита
натрия до бледно-розового оттенка. Среду смешивают, разливают по чашкам и
подсушивают в термостате.
Е. coli ферментирует лактозу с образованием кислоты. Обесцвеченный фуксин
в
среде Эндо с изменением реакции в кислую сторону приобретает первоначальный
цвет,
что
и обусловливает красный с металлическим блеском цвет колоний Е. coli.
Патогенные
бактерии — возбудители кишечных болезней — не ферментируют лактозу и
растут
на
среде Эндо в виде бесцветных колоний.
С р е д а Л еви на.
Сухая среда Левина готовится аналогично сухой среде Эндо. Пра
необходимости она может быть приготовлена ex tem pore. К 100 мл стерильного расплавлен
ного питательного агара добавляют 2 г лактозы, растворенной и
прокипяченной
^
небольшом количестве дистиллированной волы, 2мл 0.5% -ного предварительно
водного раствора метиленовой сини и 1,5 мл 1%-ного водного раствора зозина
красителей готовят заранее, стерилизуют текучим паром), 0,2 г двухосновною Ф1* ^
нокислого калия (К
2
НРО
4
), среду перемешивают и разливают по чашкам ^Рела
лилового цвета. Колонии Е. coli имеют Сине-черный цвет, бактерии, не фермент
в
лактозу, образуют бесцветные колонии. Данная среда, как и среда Эндо, исполь
настоящее время, главным образом, для выделения Е. coli
^
сотен.
С р е д а П лоски рева.
Она содержит сухой питательный агар, набор разлить^ ^ р
шли желчных кислот, бриллиантовую зелень и нейтральный красный индикаюр^^,^^„
связи с подавлением ее жизнедеятельности солями желчных кислот и^орил.^
зеленью, растут на этой среде скудно, в виде колоний розового Цвета,
Микро
ты из
4
растут (чашки н открытом виде подсушивают пн
бактерии сш,ьмонелль. образуют „а среде бесцветные про^ач„ьГколо„ии.Ч)
,
^
Э лект и вн ы е среды
( р е д а ( ент-Иваньи. в состав которой входит МП А г n
нятпио ц 0 ^ , ч ,
*
л Д|" I
vina
с о,| /о кристалл виол era и 1% азида
натрия. На .той среде вырастает только возбудитель рожи свиней
МИД
!!:'Я
ВЬ1ЛелеННЯ
ЧИСТ0Й к™
ы
гриба рода C andida применяют среду, содержащую
С ухие п и т а т ел ьн ы е среды
В последние годы в бактериологии широко используются сухие питательные среды
что позволяет лабораториям избавиться от трудоемкого процесса приготовления сред.
Технология приготовления питательных сред из сухих проега, Навеску, указанную на
этикетке, всыпают в емкость с холодной дистиллированной водой и нагревают до кипения
до полного растворения порошка.
Выпускают
обычные,
специальные,
дифференциально-диагностические
и
элективные сухие среды.
Часто приходится разливать питательные среды мерно. С этой целью в лабораторной
практике используют специальные приспособления.
О п р е д е л е н и е p H п и т а т е л ь н ы х с р ед
производится электрометрическим методом —
pH-метром. После установления pH питательной среды, (МПБ обычно имеет pH = 6,6-6,8)
доводят его до нужного (pH = 7,4). Для этого по каплям микропипеткой добавляют 0,1 н.
едкого натра в стакан с питательной средой, в который опушены электроды потенциометра.
После установления количества щелочи, необходимой для получения 7,4 pH на 1 мл среды
делаю т расчет на нужное количество. Если на 1 мл затрачено 0,08 мл 0,1 н. раствора едкого
натра, то к 10 л среды необходимо добавить 800 мл щелочи.
В о избежание разбавления питательной среды для получения необходимого pH к ней
добавляю т I н. р-р (1 нормальный раствор) едкого натра, т. е. всего 80 мл.
Для определения pH плотных питательных сред расплавленный агар или желатин,
учитывая буферность этих сред, разводят в 7 раз теплой дистиллированной водой. После
установления соответствую щ его pH среду кипятят, фильтруют, осветляю т, разливают во
флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда
становится более кислой на 0,2 единицы.
М ЕТОДЫ П О СЕВА БАКТЕРИЙ НА ПИТАТЕЛЬНЫ Е СРЕДЫ ,
ИХ К УЛ ЬТИ ВИ РО ВАН И Е, ВЫ Д ЕЛ ЕН И Е ЧИСТЫ Х КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ
При первичных посевах из исследуемого материала или посева из чистых культур
бактерий на питательные среды необходимо соблю дать строгую стерильность, чтобы не
занести посторонних микробов. В се работы по посевам и пересевам бактерий проводятся в
специальны х помещ ениях