ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 22.03.2019
Просмотров: 894
Скачиваний: 3
7
C
L
МПА
Ой
'4а
).
(Ы\
,5°
paeiyr (чашки а открытом виде umicviiiuiuu.ii .... .
Фактории са п.мо.юмы образуют на среде бесцветны Д т т п " ТСЧСИИс ' *° 1 ‘«тогожме
I
" " Ч^-ас псиюегиме прозрачные колонии
.л
м ект ивнш среды
( /*ч*» ( ент-Иваньи, в состав которой вхолш МПА^пи/ «
натрия На Ч е р е д е
т о л ь ю Т Е Х ^ л ь
....... ,,С,“ " ' % ™ ”
м . 1
а
^ “
: : : : , г гай " улмурыгрив> ■“ * - “
- п - ........ ч * * .
_ т „ ' ,юик-ан"«
в бактериологИИ широко испольтунггс* сухие ИИТК.СЛ..ИНС среды,
что по толке, .абораторилм избавиться от трудоемкого процесса иржотовдеиик сред
1 смю. Ю1 ня приготовления питательных сред ит сухих npoen 11авеску. укатанную на
'тикс
1
кс. всыпают в емкость с холодной дистиллированной водой и нагревали до кипения
до полного растворения порошка.
Выпускают
обычные,
специальные,
дифференциально-диагностические
и
элективные сухие среды.
Часто приходится разливать питательные среды мерно. С этой целью в лабораторной
практике используют специальные приспособления.
О п р еделен и е p H п и т ат ел ьн ы х сред
производится электрометрическим методом —
pH-метром. После установления pH питательной среды, (МПБ обычно имеет pH = 6,6-6,8)
доводят его до нужного (pH = 7,4). Для этого по каплям микропипеткой добавляют 0,1 н.
едкого натра в стакан с питательной средой, в который опущены электроды потенциометра.
После установления количества щелочи, необходимой для получения 7,4 pH на I мл среды
делают расчет на нужное количество. Если на 1 мл затрачено 0,08 мл 0,1 н. раствора едкого
натра, то к 10 л среды необходимо добавить 800 мл щелочи.
Во избежание разбавления питательной среды для получения необходимого pH к ней
добавляют 1 н. р-р (1 нормальный раствор) едкого натра, т. е. всего 80 мл.
Для определения pH плотных питательных сред расплавленный агар или желатин,
учитывая буферность этих сред, разводят в 7 раз теплой дистиллированной водой. После
установления соответствующего pH среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во
флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда
становится более кислой на 0,2 единицы.
МЕТОДЫ ПОСЕВА БАКТЕРИЙ НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ,
ИХ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ, ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ
При первичных посевах из исследуемого материала или посева из чистых культур
бактерий на питательные среды необходимо соблюдать строгую стерильность, чтобы не
занести посторонних микробов. Вес работы по посевам и пересевам бактерий проводите» в
специальных помещениях
5
(боксах) Инструментами лля посева
микроорганизмов служат бактериологические rie- Рассс,*а
шпатель (рис. 21)
ЛИ’ иглу
При посеве бактерий па питательные
псрссевс из одной пробирки в другую
И;,и
следующий
порядок.
Вначале
в РпняИ...Со6лК)лаю|
пламени
стерилизуют петлю и петле-держатель, который
входит в пробирку Пробирку с чистой
стерильной скошенной средой берут в
со
i*m sti
Ингтрцмснты Иля посеев и
пересева яикробоя:
в —
Ллктрриологчч^кия п**тл*; б
6лкп>рио.»«*гнчгскля
Hi-чп; я —
шио-
т*д*..
левую pvkv
наклонном положении гак, чтобы пробирка е
kv
^ ' в
была первой по отношению к работающему В
берут, как писчее перо, петлю и, держа ее
~/ЮрУку
«ертикад,*;
“ Зтные прогЖи
вынимают и держат их во время посева
* и
в
пламени
горелки.
пробки на стол. Обжипил'2*0''
края
прокаливают
захватывают мизинцем правой руки,
положении. Ни в коем случае не допускается
открытых пробирок в пламени горелки и вводят стерильную петлю в пробирку с
культлГТ
Петлю охлаждают о внутреннюю стенку пробирки, прикасаются к участку незасеянного
агара и, если он не плавится, прикасаются к поверхности культуры бактерий. Пробирк\
слегка отодвигают от пламени, предохраняя материал от сжигания. Быстро, но
осторожно
переносят петлю в пробирку со стерильной средой, опускают, не доходя до границы
конденсационной воды, и зигзагообразными движениями распределяют материал по
скошенной поверхности агара. Извлекают петлю, обжигают края пробирок и
вставляют
обожженные пробки, затем стерилизуют петлю (рис. 22).
Посев на плотные среды в чашках Петри проводят бактериологической петлей или
стеклянным шпателем. Крышка чашки с агаровой средой приподнимается левой рукой, но
полностью не открывается, наносится капля исследуемого материала и растирается на
поверхности среды (рис. 23).
При посеве уколом пробирку с агаром или желатином (среда разлита в виде столбика)
держат дном вверх или под углом. Посев производят бактериологической иглой, которой
прокалывают питательную среду до дна (рис. 24). Посев уколом в столбик применяется для
выращивания анаэробов, выявления протеолитических свойств, а также с целью
длительного хранения культур.
Для посева на жидкие среды пользуются петлей, стерильными градуированными или
пастеровскими пипетками. Техника посева на жидкие среды петлей аналогична технике
посева на скошенный агар, но материал на петле растирают по стенке пробирки и смывают
питательной средой.
казенным пинцетом, пипетку ппп СК° И Пипеткой кончик капилляра отламывается про-
Р€ЗИн ов ы й
баллончик и опуска В°^ ЯТ чеРе * пламя На другой конец пипетки надевают
Небольшое количество мате
Т СС В пР°бирку с жидким исследуемым материалом
переносят материал в пробил ; И^Ла^ избирают путем легкого нажатия на баллончик и
ГРУш и. После посева мастегн ^ ° незасеянной питательной средой, выдувая его с помощью
М ЕТОДЫ
К
У
Д
Ы
I
Ж
1 -д°|^е,ДаК)1В ле ^инфицирующий раствор
проведенного
посева нсобч,пшиР<жа,1ИЯ бактерий, кроме правильно подобранных среди
® среднем температура
<>ЛИМЬ| 0,11 имш ,ь,,ые условия, температура, влажность,аэрация,
пределах 3 7 -38°С
' *Я кУ;,ьгивиР°вяния большинства микробов должна быть в
аппарат — термостат
к микР()бом в лабораторных условиях используют специальный
(рис. 25).
(,(> Р()М поддерживается постоянная и определенная температура
6
а
i.
Р»*с. 22
П е р е с е в и.и о д н о й , п р о б и р к и я д р у г у ю
Рис. 23
Посев шпателем в чашку Петри с плотной питательной средой
Термостаты бывают различного устройства и размера. Термостат представляет
собой шкаф с полками внутри и открывающейся дверцей, сделанные из теплоизолирующих
материалов.
Источником
нагрева
в
современных
термостатах
являются
электронагревательные элементы, которые прогревают воздух или воду.
Сущ ественной частью любого термостата является система терморегуляции,
которая обеспечивает поддержание температуры на оптимальном уровне. Датчиком
температуры в большинстве термостатов является ртутный контактный термометр с
магнитной головкой. Такой термометр имеет два контакта, один из которых представляет
собой платиновую подвижную проволоку, заключенную в канат термометра другой
присоединяется к ртути. Уровень температуры по положению подвижного контакта
регулируется магнитной головкой. При нагревании термостата выше 37°С замыкаются
контакты термометра и сигнал поступает в электронное устройство, которое с помощью
реле отклю чает источники нагрева. При снижении температуры контакты размыкаются и
подается сигнал для включения источников нагрева. 1аким образом, в термостатах
постоянно поддерживается нужная температура.
В больш их лабораториях по такому же принципу создаются комнаты-термостаты.
С вет подавляющему большинству патогенных микробов не нужен: их культивируют
в темноте. Однако для изучения пмгментообразования, которое происходит активнее на
7
рассеянном свету, бактериальные культуры после гермоегата выдерживали
i
K O M H .il
ном освещении
‘ ‘Ия
"Ри
Для
успешного культивирования бактерий необходимо примем*
питательные среды, содержащие определенное количество штат и Особенно "
использования плотных питательных сред, которые разливают и чашки и
° *ас*г*ся
пробирках в день посева
^‘“ин^^г, „
При выращивании аэробов и факультативных анаэробов аэрация пг*
естественных условиях без применения каких-либо дополнительных приспособ
'* ' > Я т *
Сроки культивирования большинства патогенных микроорганизмов СОсгЛвИий
о есть культуры, растущие медленно
до 4-6 недель.
24
ч. но
МЕТОДЫ ВЫ ДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫ Х КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ
Морфологические, культуральные и биохимические особенное!и микрооп
необходимые для определения вила с целью постановки бактериологического
1ГЙ4°*
изх’ЧЯЮТ, используя чистые культуры бактерий.
’ ДИагиоза.
Микробы, выделенные из внешней среды, организма животных или
*
м
размноженные на питательных средах, называю т культ урам и.
В исследуемом материале патогенные микроорганизмы во многих ст ,г
находятся в числе других, чаще сапрофитных бактерий. Выделить чистую Л 1‘ьп Х
возбудителя болезни является основной сдачей при проведении бактериологиям к
й
диагностики.
Чистая культура микробов содержит только один вид микроорганизмов, который
определяется по совокупности его свойств. Культура микроорганизмов, выделенная из оп
ределенного источника (организм ж ивотного, воздух, почва и др ), получила название
ш т ам м
.
Если выделенная бактериальная культура одного вида различается по некоторым
признакам, то она называется вари ан т .
Методы выделения микроорганизмов из исследуемого материала можно отнести к
двум группам — механические и биологические.
М еханические методы
Они основаны на механическом разъединении одной бактериальной клетки от
другой с целью получения отдельны х изолированных колоний на плотной питательной
среде После культивирования посевов в терм остате из отдельной ну жной колонии делается
пересев на питательную среду, в которой вы растаю т чистые культуры бактерий
1-й день исследования
Из исследуемого материала готовят мазки и окраш иваю т их по Грам> При
микроскопии устанавливаю т наличие бактерий, их морфологические
особенности и
отношение к окраске по Граму.
Для получения изолированных колоний исследуемы й материал высеваю i HJ
поверхность плотной питательной среды в чаш ках Петри.
Атар в чашки разливаю т следую щ им образом : флакон со стерильной ш п ак «ьн^и
средой помешают в водяную баню до 4 2 °С . П осле расплавления агара и его oviaaaew
флакон беру т в правую рук\ юной р> кой изв лекаю т пробку, обж ш акн горлышко
•миыиим и указательным пальцами левой руки сл егк а приподнимаю» крыи|К>
^
Вводят горлышко флакона иол крышкл чашки (н с касаясь краев), напиваю»
питательного аг ара, б ы с i ро вмиг» щ
горлышка флакона п о д во д я i
покачивая крутоными жижениями чашкл. д о сти гаю т равномерного р......,
мост*1*
Чашки о ставл я ю ! на ч ес к* пока среда нс тасгынст, а затем их
перенося»
^
поворачивая вверх дном, снимав»! крышкл и остаиляю т в гаком виде на I
подсушивания
рышкой Края
ил ка
I орды in ко флакона и закры ваю т чашку Ч
к пламени и шкрынают его обожжено»» пробков
определена* среды
X
Для выделения чистой культуры
Существует несколько методов посева материала
бактерий.
П о с е в н а чашки шт рихом
производится ппи т ш а ,,,,,
Ф помощи петли, которой нйбиоают
небольшое количество исследуемого материала и не Ru Uu..o„
^ наоирают
н
и, не вынимая петлю из пробирки
стряхивают излишнее его количество. Чашкх с питате-^ылы
F
H '
1
гг
-
«
-
питательной средой помещают на столе
вверх дном Левон рукой берут дно чашки, держа ее почти вертикально и густо
заштриховывают
петлей небольшой участок агара в верхней части чашки. Петлю следует держать
свободно большим и указательным пальцами правой руки, ближе к концу петледержателя
О свободив таким образом петлю от излишнего материала, легкими движениями, не
повреждая поверхности среды, наносят, отрывая друг от друга, параллельные штрихи на
расстоянии около 0,5 см.
В отдельных случаях можно производить последовательный рассев материала,
используя для этого несколько чашек с питательной средой. Набрав петлей небольшое
количество материала, производят посев штрихами на первой чашке и той же петлей, не
набирая материала, вновь наносят штрихи на вторую и третью чашки с питательным
агаром. На первой чашке обычно получают рост в виде сплошных штрихов, на второй и
особенно на третьей бактерии развиваются в виде изолированных колоний (рис. 26).
П о с е в ш п ат елем
Посев исследуемого материала нередко производят шпателем,
который заранее заворачивают в бумагу и стерилизуют горячим воздухом. Исследуемый
материал в количестве одной петли или капли наносится пастеровской пипеткой в центр
чашки со средой, каплю шпателем распределяют на небольшом участке среды, а затем
круговыми движениями по всей ее поверхности Во время посева крышка чашки,
поддерживаемая левой рукой, остается слегка открытой
Ш патель из первой чашки быстро переносят во вторую чашку, а затем в третью По
окончании п осева шпатель погружают в банку с дезинфицирующим раствором Чашку с
соответству ю щ ей надписью на дне помешают в термостат вверх дном для того, чтобы
конденсационная вода, скапливающаяся на внутренней поверхности крышки, не
Ршс. 26
Р(н т бакт ери й н а п лот н ой пит ат ельной среде
при по*'jedittfuт ельном посене
попадала на п оверхность посева и не размывала выросшие колонии
2 -
й день исследования
И зучаю т культу ральные свойства чистой ку льтуры выросшей колонии на третьей
чаш ке. Их изучаю т невооруж енны ч глазом, с помощ ью лупы, при малом увеличении
м икроскопа н иногда под стереоскопическим микроскопом.
Ну жну ю колонию отм ечаю т с о стороны лна восковым карандашом. Из нее делают
м азок и окраш иваю т по Грам\ При микроскопии изучают морфологические особенности
и отн ош ен и е бактерии к окраске но I раму Из этой колонии делают пересев на питательные
сред ы (М П А и М П Б ) П осевы помеш аю т в терм<хггат для культивирования.
3 -
й д ен ь исследования
И зу чаю т культуральны е свой ства бактерии на МПА и МПБ, делают мазок,
о к п а ш и в а ю г по Грам\. микроскоииру ют. У бедивш ись в том. что бактериальная культура
9