Файл: питательные среды.pdf

ее  биохимических  (ферментативных)  св 
от чувствительность  к  антибиотикам  и лп 

С1В'

чистая, 

приступаю! 

к 

изучению  ее

устанавливают подвижность, определяю!  ij'iivmnii.jiDnuviD  «'  uun-ivM-iv/iimaM  и др

В  научно-исследовательской  работе,  особенно  при  генетических  исследован 

необходимо получать культуры заведомо из одной клетки  Такая  культура называется  ЯХ 

Для  ее  получения  чаще  всего  пользуются  микроманипулятором  Этот  прибор  сна(Г°* 
инструментами  (иглами,  пипетками)  микроскопических  размеров.  С  помощью  д е р ж а в " 
под контролем  микроскопа их  вводят в препарат с бактериями  на предметном стекле и 

* 

нужную клетку засеваю т в питательную среду 

Биологические  методы

одну

Они  основаны  на  учете  тех  или  иных  биологических  особенностей 

выделяе 

бактерий  в  чисгую  культуру.  Выделение  спорообразукшщх  микроорганизмов  njT  
выделении  чистых  культур  из  исследуемого  материала,  содержащего  споровые  ф0пм 
микробов, его прогревают  10 мин при 80°С  или 2-3  мин  при  100°С  в расчеге на то, что менее 

стойкие  неспоровые  формы  погибнут  при  этой  температуре.  При  этом  споровые  формы 

останутся  жизнеспособными.

Из  прогретого  материала  проводится  посев  на  питательные  среды,  на  которых 

вырастают спорообразующие  микроорганизмы.

Выделение  кислоустойчивых  микроорганизмов

Для  выделения  чистой  культуры  возбудителей  туберкулеза  и  паратуберкулеза  из 

патологического  материала  используют  химический  метод.  С  этой  целью  исследуемый 
материал  после  его  гомогенизации  обрабатывают  10%  -ным  раствором  серной  кислоты  в 

течение  5-7  мин,  добавляя  ее  в  равном  объеме.  Благодаря  этому  погибают  микробы  со­
путствующей  микрофлоры,  а  кислотоустойчивые остаю тся  жизнеспособными.

После  нейтрализации  раствора  кислоты  проводят посев  на специальные питательные 

среды,  на которых  вырастают кислотоустойчивые  микробы.

Выделение  подвижных  микроорганизмов (м етод Ш у-кевича)
Исследуемый  материал,  из  которого  выделяется  подвижный  микроб,  засевают  в 

конденсационную  воду  скошенного  МПА.  При  посеве  необходимо  следить,  чтобы  петля  с 
материалом  не  коснулась  поверхности  среды  над  конденсационной  водой.  Бактерии, 

обладающие активной  подвижностью,  вырастут  не только  в  конденсационной  воде,  но и вне 
ее.  на  поверхности  МПА.  Из  верхней  части  роста  производят  повторно  посев  в  конденсат 
свежей  питательной  среды.  Производя  таким  образом  несколько  пересевов,  в  конце  концов 
получают  чистую  культуру  подвижных  бактерий.

Выделение  патогенных  микроорганизмов
Чистые  культуры  патогенных  бактерий  вы деляю т  путем  заражения  исследуемым 

материалом  лабораторных  животных,  наиболее  восприимчивых  к  тому  или  ином>  воз­

будителю.

После  гибели  животного  из  крови  и  органов  трупа  делают  посевы  на  питательные 

среды,  на  которых  в  больш инстве  случаев  вы растает  чистая  кульгура  возбудителя  (>тот 
метол  подробно представлен  в  геме «М етоды  заражения  лабораторных животных  »)

МЕТОДЫ  КОЛИЧЕСТВЕННОГО  И  КАЧЕСТВЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ  МИКРООРГАНИЗМОВ

В И ССЛЕДУЕМ Ы Х О БЪЕКТАХ

Число  клеток  в  единице объема  на  ф иксированных  окрашенных  мазках определяюi 

непосредственным  подсчетом  их  под  микроскопом  либо  косвенно  —   путем  у ч а л  Р0<- 

микроорганизмов 

на 

питательных 

средах 

после 

ирсдвар 

тельного  вы сева определенною  объема  исследуем ого  субстрата.

П одсчет  микроорганизмов  под  микроскопом 

'ктов

Этот  метод  рекомендуется  исп ользовать  для  подсчета  крупных  ° оьс 

дрожжей,  грибов  и  некоторых  относительно  крупных  бактерий.

К)

Например,  ознакомиться  с  морфологией 

микроскопирования  капли  бродящей  жидкости  , , Т >ЖЖС1' ЫХ  1 РиГ«>в  можно  путем 

стп  наносят  каплю 

.... 

АЛЯ  Пп' п  -------

бродящей  жидкое'

каплю  на

Мнкрокартину  дрожжевых  грибов 

зарисовать

1

1

ри 

микроскопировании

предметное  с т е м Г Т " » *   " Ш10ЧКОЙ  т  

культурных  „  диких  ДР..ЖЖСЙ 

Р° СК0" ИРУЮТ

необходимо

Дрожжевых

произвести  определение состояния  живых  клеток  и 

bi

 m  > 

грибов 

следует

Определение  проводят  следующим  образом'^  ° ЛИТЬ  процснт  мертвых клеток 

предметном  стекле  готовят препарат,  подкрашивают м ети л ен о Г Т ДИВШеЙ  жидкости  на 

окрашиваются  в  синий  цвет,  а  живые  клетки  остаются”  '6" 080** Синью  МсР™ые  клетки 
число 

окрашенных 

и 

неокрашенных 

клеток *  НСОКрашенными  Подсчитывают 

полях  зрения  и  высчитывают,  какой  процент они составляют 

ЧСМ 

В 

ПЯТИ

Для  определения  содержания  дрожжевых  клеток  в  боодяшей  * ИП

метолом 

к 

родящей  жидкости  пользуются

“

ых  к а м е п Г   .М

тИКроско" 1;чес'«>го  счета  в  специальных

тоелельных  п Р 

( 

Ма  ~   Цейсса'  Г° Р * " >   " ™   методом 

предельных разведении путем  культивирования  на средах.

Обычно используют  камеру  Горяева (см. рис.  27), она 

представляет собой толстое  предметное стекло, разделенное 
бороздками.  На  центральную  часть  (сверху  и  снизу  борозд­

ки)  нанесены  сетки.

Площадь  квадрата  сетки  указана  на  одной  из  сторон 

предметного  стекла  и  соответствует  1/25  мм2  (большой 
квадрат)  или  1/400  мм2  (малый  квадрат).  Часть  предметного 

стекла,  на  которой  нанесена  сетка,  на  ОД  мм  ниже  двух 
других  сторон.  Это  глубина  камеры;  она  всегда  тоже 
указывается  на предметном  стекле.

При работе с камерой  необходимо соблюдать опреде­

ленный порядок ее заполнения.  Вначале углубления с сеткой 

покрывают специальным  шлифованным  покровным стеклом 
и, 

слегка 

прижимая, 

смещают 

покровное  стекло  в 

противоположные  стороны  до  появления  колец  Ньютона. 
Это  указывает  на  то,  что  покровное  стекло  притерто  к 

сторонам  камеры.  Т ол ько  при таком условии объем  взвеси  микроорганизмов,  находящийся 
камере,  со о тв етств у ет расчетному.  После этого  камеру  заполняют исследуемой суспензией 
микроорганизмов.  С успензию   вносят  через  бороздки  камеры  капилляром  или  пипеткой. 
П одсчет  клеток  рекомендуется  начинать  через  3-5  мин  после  заполнения  камеры,  чтобы 
клетки  при  микро-скопировании  были видны  в одной  плоскости.

Число клеток подсчи ты ваю т с объективом  х8 или х40. Обычно подсчитывают клетки 

микробов  в  10  больш их  или  2 0   малых  квадратах  сетки,  перемещая  объектив  по диагонали. 
У читы ваю т  все  клетки,  лежащ ие  в  квадрате сетки, а также  клетки,  пересекающие  верхнюю 
и  правую   стороны  квадрата.  Количество  клеток  в  1  мл  исследуемой  суспензии  вычисляют

по формуле

м

=

а

' 1 0

Рис. 27

Счетная камера Горяева

  —  

Тома: 

а

 — вид сверху; б — вид сбоку; в — при 

малом увеличения микроскопа.

h-S-n

где  М  —   число клеток  в  1  мл

И -

  глубина  камеры,  м м;  S - ^

’'“^ ^ « л е д у е м о П   суспензии, 

в  единую  си стем у   измерения,  п 

р

11

Существуют и другие методы прямого счета клеток,  например метод Брида 

Королева.  По  методу  Брида  готовится  определенное  разведение.  Отвешенное 

меренное  количество  исследуемого  материала  разводится  в  определенном  к  ИЛИ 0т* 
жидкости,  из  которой  микропипеткой  отбирают  0,01  см3  и  равномерно  распре 1c.Ji4CcrBc 
площади  в  I  см2.  Мазок сушат, фиксируют и  красят метиленовой синью. Считают 

,<а 

отдельных  полях  зрений  (в  10  различных  местах  мазка)  'Затем  определяют  плоп -  61 Ки h 

ння  по  формуле  площади  круга  (яг2).  Зная  объем  жидкости,  взятой  лл«  1, альпо;1я

лика,  площадь  поля  зрения  и  среднее  количество бактерий  в одном поде 
ычислить  в  1  см3  жидкости, а отсюда, учитывая  разведение, —  в единю  *

пересчета, 

прения.

единице объема

зрения
площадь  мазка,

ЛеГКО 

ИХ 

ВЫЧИСЛИ! 

или веса исследуемого продукта

Определение количества клеток высевом  на плотные питательные среды (чаше 

метод  Коха) 

Ный

Сущность  метода  заключается  в  высеве  определенного  объема  иссле 

суспензии  микроорганизмов  на плотную  среду  в  чашки  Петри  и  подсчете выросшихСМой 
инкубации  колоний.  Принято считать,  что  каждая  колония —  потомство одной клетки^^ 

Работа  этим  методом  включает  три  этапа:  приготовление  разведений  посев 

плотную среду  в  чашки  Петри  и  подсчет выросших  колоний.

Приготовление  разведений.  Численность  популяции  микробов  обычно достаточно 

велика,  поэтому для  получения  изолированных  колоний  необходимо  приготовить ряд пос­

ледовательных  разведений.  Разведения  готовят  в  водопроводной  воде,  используя 
постоянный коэффициент разведения, чаще всего равный К. Для  приготовления разведений 
стерильную  водопроводную воду разливают по 9  мл  в стерильные сухие пробирки. Затем  1 
мл  исследуемой  суспензии  стерильной  пипеткой  переносят  в  пробирку  с 9  мл  стерильной 
воды —  это  1-е разведение (Ю '1).  Полученное  разведение тщательно  перемешивают новой 

стерильной  пипеткой,  вбирая  в  пипетку  и  выпуская  из  нее  полученную  взвесь.  Эту 
процедуру  выполняют  3-5  раз,  затем  этой  же  пипеткой  отбирают  1  мл  полученной 

суспензии  и  переносят  во  2-ю   пробирку  —   получают  2-е  разведение  (10‘2).  Таким  же 
образом  готовят  и  последующие разведения.

Для  приготовления  каждого  разведения  следует  обязательно  использовать  новую 

пипетку.  Пренебрежение этим  правилом  приводит к получению ошибочного результата.

Проведение 

посева. 

Перед 

посевом 

поверхностным 

способом  разливают 

расплавленную,  чаще  всего  агаризованную,  питательную  среду  в  ряд  стерильных  чашек 
Петри по  15-20  мл  в каждую.  Чашки оставляют на горизонтальной  поверхности, пока среда 
не застынет.  После того  как  среда  готова,  на ее  поверхность  стерильной  пипеткой наносят 

точно  измеренный  объем  (0,05  или  0.1  мл)  соответствующего  разведения  и  распределяют 
его стерильным  шпателем  по  поверхности  среды.  Высевы  на плотную среду  проводят, как 
правило,  из трех  последних разведений.  После  посева  чашки  Петри  помешают в термостат 

крышками  вниз.

Подсчет  выросших  полоний.  Колонии  бактерий  подсчитывают обычно  мере?-'  ‘-У1- 

колонии грибов  и дрожжей —  через 5-7 сут инкубации  в термостате.  Подсчет, как правило, 
проводят,  не  открывая  чашек  Петри.  Для  удобства  чернилами  или  карандашом 

по 

стеклу 

отмечают  просчитанную  колонию точкой  на дне  наружной  стороны  чашки

Количество  клеток  в  I  мл  исследуемого  субстрата  вычисляют  по формуле

М

  =

а

  1 0 -  

п 

V

где  М 

количество  клеток  в  I  мл  а  

среднее  число  колоний  при 

} 

разведения;  10 

коэффициент  разведения:/? 

порядковый номер Раше'1\1П|Як0 ,

оний

  при 

сделан  вы сев;  V 

объем  суспензии,  взятый  для  посева,  мл.  Для  подсче

большом их  количестве используют метпп 

.г

приемами 

ОД выбоР°чного подсчета, п о л ьа»,.

I  Со  стороны  дна  площадь  чашки  дел 

специальными

секторов (на 4  или 6,  или  8). 

' 

* "   вос«овым  карандашом  на  ровное  чист

Число колоний подсчитывают в одном  и , сектой,,»  п 

умножают  на  число  секторов.  Таким  обратом  вы ч и слю ,^ '"Лученное количество колоний 

росших  на всей  площади  чашки 

'  00ще€  количество  колоний  вы-

2.  Тем  или  иным  приемом  определяют cnPnUM 

площади  I  см 2. 

число  колоний,  которое  выросло  на

Предварительно вычисляют площадь чашки по формуле S  РЙ1  г  

имеет радиус  5  см,  следовательно,  ее  площадь равна 3  14  *25  = 

7 8

2

  етандаРтная чашка

Среднее  число  колоний,  выросших  на  площади  1  см2 у м н п Г  

Полученное  число  выражает  общее  количество  колоний  „ Л  

акуг  на пл°шадь чашки 

ности  чашки. 

’ 

°Р °е вь,Р°сло  на  всей  поверх-

И сп ол ь зов а н и е  т р а ф а р ет а   (ш абл он а)

Со  ст ст »*. 

трафарет,  который  имеет  пять  окон,  площадь  каждого  из  них  с о ^ а в л я Г ]  

колонии осущ ествляется в  пяти окнах,  после чего общее количество колоний делят на п я Г  
получая  среднее число  колонии,  выросших  на площади  в  1  см2

И сп о л ь зо в а н и е  сч ет н ой   кам еры .

  Счетная  камера  представляет  собой  стеклянную 

пластинку,  укрепленную  на деревянной  подставке.

Пластинка  разделена  на  144  квадрата,  каждый  из  которых  равен  1  см2;  квадраты, 

расположенные  по диагонали,  в свою  очередь разделены  на 9  малых квадратов каждый.

Для  подсчета  колоний  чашку  помещают  под  стеклянную  пластинку  вверх  дном  и 

подсчитывают  число  колония  в  10  квадратах  (если  колоний  много,  считают  в  малых квад­
ратах).

Определив  среднее  число  колоний  на  1  см2 среды,  умножают это число  на площадь 

всей  чашки  и таким образом  высчитывают число  колоний на всей  поверхности среды.

И с п о л ь зо в а н и е   а п п а р а т а   для  п одсч ет а  колоний.

  Принцип  подсчета  в  этом  случае 

остается  таким  ж е,  как  и  в счетной  камере.

В м есте  с   тем  аппарат  имеет  дополнительные  приспособления,  позволяющие 

ускорить  подсчет  колоний,  стационарную лупу,  подсветку  со 
сменными 

светофильтрами. 

авторучку 

с 

датчиком;

одновременно 

с 

отметкой 

колоний 

количество 

их

фиксируется  на счетчике (рис.  28).

При  обработке  данных  по  определению  количества 

бактерий  в  исследуемых  объектах  принимают  во  внимание 

следующие  положения:

1)  оценивают  только  те  разведения,  при  посеве 

которых  выросло  на чашке от 30 до 300  колоний;

2 )  полученные результаты округляют

3) для определения  общего  числа бактерии  в  иссдедхе- 

мых  объектах  (в  почве,  в  кормах  в  .  г.  в  воде  в  1  « H je o f e o -  
димо  полученное  число  колоний  умножить  на  степень  раз

ведения  исследуем ого  материала. 

,  , 

цятках  выросло  120 колоний

I (апример,  при  посеве  1  мл  воды  в разведении  М °  начаишахвыг

Содерж ание бактерий  в  I 

мл 

волы  составляет 

* 

“ 

Н)СГ||  ( с а -кляннын  стандарт

И сп ользован и е  ст ан дарт а  мутности

'  Р 

иблизнго1ьно соответствующих

мутности

)  —   в звесь  мельчайших  ч а с т и  ч е к -  

витального  измерения  мутности

по  величине  бактериям;  служит  .талоном  для  прямого

|*ис.2а

Аппарат дл я подсчет а колоний: 

I

столик дли чашки Петри; 2  -  *«!>■ 

кт-рс-датчиком: X -   счетчик; 4  -   тумб­
лер дл* ВКЛК.'ККИЯ  импульсного «WT- 

H H v.n: 6

  — 

гу мЛлер 

для 

включения »ОД‘ 

гнетяИ.

бак 

Iери алы iых 

препаратов 

Международный стг 

взвеси,  содержащей  10  млрд  KOKJ

10  КД в  1  мл (что соот

BcrcTBver мутности

Международный стан;*арт 

д “я" В1;|0рИНарнон  практики  ВГНКИ

13

изготовляет бактериальные стандарты из культур Salm onella pullorum,  используя в ка> 
эталона также стеклянный стандарт мутност и. 

естве

Бактериологический  метод подсчета (метод отпечатков)
Метод применяется для  оценки  свежести  пищевых  продуктов (мяса), однако  м 

быть использован и для ориентировочной оценки количественного и качественного со  Ж<Л 
микрофлоры других  продуктов (рыбы,  полуфабрикатов). 

a,ia

Для  микроскопического  исследования  из  проб  мяса  готовят  не  менее  mpv  ..

ez 

1

  ^

М<ПКОВ-

отпечатков:  один  из  поверхностного  слоя  с  глубины  1-2  мм,  другой  с  глубины  2-2 5 
третий с глубины 3-3,5 см.

При  кол и ч естве  бактерий

Р езу л ьтат округляют

от  1  до  100

полученное  число

от  101  до  1 0 0 0  

от  1001  до  10  0 0 0

до  10

от  1001  до  10  0 0 0

до  100

от  10  0 0 1   до  1 00  0 0 0

до  1000

о т  1 0 0   0 0 1   до  1  0 0 0   0 0 0

до  10  0 0 0

Для  приготовления  препарата-отпечатка из  поверхностного слоя  мяса стерильными 

ножницами  вырезают  кусочек  0,5-1  г  и  срезанной  стороной  делают  тонкие  отпечатки  на 

слегка подогретом  предметном  стекле.  Чтобы  приготовить препарат-отпечаток из глубоких 
слоев,  поверхность  мяса  сначала  прижигают  нагретым  шпателем,  а  затем  стерильным 
скальпелем  производят глубокий разрез, пинцетом раздвигают края, вырезают кусочек мяса 
и,  прикладывая  к  поверхности  предметного  стекла,  делают  отпечатки.  Приготовленные 
мазки  подсушивают  на воздухе;  фиксируют  на  пламени  спиртовки,  окрашивают  по  Граму 

и  микро-скопируют.  Просматривают  не  менее  пяти  полей  зрения.  В  каждом  поле 
подсчитывают  отдельно  кокковые  и  палочковидные  микробы,  а  затем  вычисляют  их 

среднеарифметическое количество  в одном  поле зрения  (рис.  29).

М и кроскоп и ровани е .м азков-от п ечат ков м я с а :

I  —

  свеж ее:  2 

сомнительной  свежести;  3 —   несвежее.

j  -   S. ftfcfi*: <* — .V '.vm'.»!*:*  .цтя*т»Л|

1

<м>'Мм«и*,

1

акт

1

'

1

*и*-

14