ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 18.07.2019
Просмотров: 2126
Скачиваний: 2
46
Якщо посівний матеріал отриманий від культури у експоненціальну
фазу – ріст почнеться зразу без вираженої лаг-фази.
Експоненціальна фаза характеризується діленням клітин, при цьому
питома швидкість росту залишається постійною.
В результаті виснаження лімітуючого субстрату або накопичення
продуктів метаболізму, які пригнічують ріст, збільшення клітин
припиняється і культура переходить у стаціонарну фазу. Біомаса
залишається постійною, метаболізм змінюється. В цей період
синтезуються вторинні метаболіти.
Фаза відмирання – енергетичні запаси закінчуються, метаболізм
припиняється. Ферментацію зупиняють у стаціонарну фазу.
ПЕРІОДИЧНЕ
КУЛЬТИВУВАННЯ
З
ДОДАВАННЯМ
СУБСТРАТУ – до культури періодично додають поживні речовини, а
культуральне середовище не видаляють до кінця культивування. У
ферментер періодично додають субстрат, а кінцевий продукт збирають
лише по завершенню культивування. Додавання субстрату призводить до
подовження експоненціальної та стаціонарної фаз, а також до збільшення
біомаси та кількості метаболітів.
У стаціонарну фазу мікроорганізми синтезують протеолітичні
ферменти, які руйнують усі білки. Тому, якщо метою культивування є
отримання білкових продуктів, треба зупинити ферментацію до цієї фази.
В залежності від генотипу мікроорганізмів та природи рекомбінантного
білка під час періодичної ферментації з додаванням субстрату вихід
продукту може зрости на 25-1000% у порівнянні з простою періодичною
ферментацією. Періодичне культивування з додаванням субстрату можна
використовувати для культивування клітин тварин та комах.
БЕЗПЕРЕРВНЕ КУЛЬТИВУВАННЯ – свіже культуральне
середовище надходить у ферментер безперервно, паралельно відводиться
така сама кількість клітинної суспензії.
Безперервна культура характеризується стаціонарними умовами –
видалення клітин урівноважується їх збільшенням за рахунок поділу.
Широке розповсюдження набули такі системи:
Хемостат - сталість хімічних характеристик та складу середовища,
у якому знаходяться мікроорганізми Це процес, при якому у культуру з
постійною швидкістю безперервно подається свіже поживне середовище,
47
а об‘єм культури підтримується на постійному рівні шляхом
безперервного видалення частини культуральної рідини. Базується на
твердженні – абсолютна концентрація клітин не залежить від поживних
речовин, які знаходяться у середовищі і лише від субстрату, якій лімітує
ріст. Середовище складають так, щоб усі поживні компоненти були у
надлишку у порівнянні з компонентами, які необхідні для синтезу
клітини у необхідній концентрації. Цей єдиний компонент, якого не стає
лімітує ріст та контролює величину мікробної популяції у сталому стані.
Турбидостат – це культивування де постійна концентрація
мікроорганізмів підтримується шляхом регулювання оптичної щільності
культури. У разі перевищення встановленого рівня вмикається насос, якій
подає свіже середовище.
Cистема безперервного культивування поршневого типу –
дозволяє імітувати періодичне культивування. Використовується лише у
лабораторних умовах.
СТЕРИЛЬНЕ
ТА
НЕСТЕРИЛЬНЕ
КУЛЬТИВУВАННЯ.
Ідеальний варіант припускає 100% домінування виробничої культури.
Однак, на практиці ця умова не виконується. Реально вдається забезпечити
переважний ріст та життєздатність штаму-продуценту. Особливо це має
значення на початку ферментації. У подальшому з‘являється стороння
мікрофлора і завдання біотехнолога створити умови культивування, які б
пригнічували ріст сторонньої мікрофлори. Це так звана нестерильна
ферментація, яка насправді не існує, тому що створюються такі умови, які
забезпечують домінування виробничого штаму над сторонньою
мікрофлорою. Приклад - культивування у безперервних умовах кормових
дріжджів, отримання оцтової кислоти при низьких рН, отримання
кормового вітаміну В
12
та анаеробне бродіння органічних речовин з
використанням термофільних мікроорганізмів в температурних умовах 50-
55
о
С. також можна збільшити частку посівного матеріалу до 20-25%.
АЕРОБНЕ ТА АНАЕРОБНЕ КУЛЬТИВУВАННЯ. Під час
аеробного культивування мікроорганізми потребують кисню у середовищі.
Це досягається шляхом забезпечення необхідної концентрації розчиненого
кисню у рідкому середовищі, шляхом надходження кисню по трубах
(барботерах) з малими отворами по всій довжині. При цьому кисень
48
надходить у середовище у вигляді дрібних пухирців, які розчиняються під
дією мішалки.
Інколи використовують анаеробне культивування, наприклад для
отримання вітаміну В
12
.
ЗАВДАННЯ.
1. Провести контроль морфологічних характеристик мікроорганізмів
шляхом фазово-контрасної мікроскопії.
Лабораторна робота № 9.
КОНТРОЛЬ ПАРАМЕТРІВ РОСТУ ВИРОБНИЧИХ
ШТАМІВ-СУПЕРПРОДУЦЕНТІВ
ПІД
ЧАС
КУЛЬТИВУВАННЯ.
Мета: опанувати методи прямого та непрямого визначення якісних
та кількісних характеристик біомаси.
Визначення концентрації мікроорганізмів та клітин під час
оптимізації процесів глибинного культивування у біореакторах можливе
прямими та непрямими методами.
ПРЯМІ МЕТОДИ визначення концентрації мікроорганізмів
базуються на кількісному аналізі здатності клітин до розмноження на
щільному або рідкому середовищі. Життєздатність будь якої культури
визначається відношенням числа клітин, здатних розмножуватися на
адекватному середовищі до загального числа мікробних клітин. Слід
враховувати, що у будь якій популяції існує не менше п‘яти типів клітин:
повноцінні, неушкоджені;
злегка ушкоджені, що швидко відновлюються;
сильно ушкоджені, що повільно відновлюються;
незворотно ушкодженні, проте обмін речовин ще
відбувається;
мертві.
Серед прямих методів визначення концентрації слід виділити
наступні:
Висівання на щільне середовище
49
Електрооптичний
Флюорометричний
Мікрокультуральний
Оптичний (лазерний)
Максимальне розведення
ВИЗНАЧЕННЯ
КОНЦЕНТРАЦІЇ
МІКРООРГАНІЗМІВ
ШЛЯХОМ ВИСІВАННЯ НА ЩІЛЬНЕ СЕРЕДОВИЩЕ. Розроблені
спеціальні прилади для механізації візуального підрахунку клітин, що
виросли на чашках Петрі з використанням підсвічування та збільшення,
електронним детектором. Аналіз розвитку мікроорганізмів та клітин на
агаризованих та інших середовищах використовують не лише з метою
виявлення частки життєздатних клітин, а також задля виявлення
пошкоджень. Для цього у агарізоване середовище вводять певні речовини
та порівнюють характер розвитку мікробної популяції на нормальному та
модифікованому середовищі (наприклад, додаючи у середовище солі
жовчних кислот виявляють у грам негативних бактерій наявність дефектів
у зовнішній мембрані).
НЕПРЯМІ МЕТОДИ дозволяють характеризувати здатність
мікробних клітин розмножуватися на підставі їх фізіолого-біохімічних,
морфологічних, тинкторіальних та інших властивостей. Використання
непрямих методів скорочує час аналізу. Аналіз базується на даних
кореляції між кількісними змінами досліджуваної властивості
мікроорганізму та рівнем життєздатності або числом життєздатних клітин
у культурі, які можна визначити прямими методами. Така кореляція
проявляється після екстремальних дій (кип‘ятіння, обробка хімічними
реагентами, заморожування), коли відбувається 100% інактивація клітин.
Тому результати непрямих досліджень завжди мають місце вірогідності
похибки.
Серед непрямих методів визначення концентрації клітин у біомасі
слід виділити наступні:
мікроскопічний (циторефрактометричний)
цитохімічний
біофізичний
біохімічний
теоретичний
Мікроскопічний метод визначення концентрації мікроорганізмів
базується на можливості аналізу частки життєздатних клітин за допомогою
50
мікроскопії у темному полі або фазового контрасту у випадку грубої
коагуляції їх внутрішньоклітинного вмісту або лізису.
КОНТРОЛЬ МОРФОЛОГІЧНИХ ХАРАКТЕРИСТИК
МІКРООРГАНІЗМІВ ШЛЯХОМ ФАЗОВО-КОНТРАСНОЇ
МІКРОСКОПІЇ.
За допомогою звичайного світлового мікроскопа можна досліджувати
лише висококонтрастні об'єкти, тобто ті, які порівняно з фоном
інтенсивніше поглинають світлові хвилі, що йдуть від конденсора. Щоб
підсилити цей ефект, об'єкти дослідження, як правило, фарбують. Такі
об'єкти називають амплітудними. Іноді виникає необхідність досліджувати
малоконтрастні об'єкти, тобто ті, що майже не змінюють, порівняно з
фоном, потік світлових променів (у звичайному мікроскопі дослідник їх не
бачить або лише відмічає ледь помітне зображення). Неконтрастними є
непофарбовані біологічні об'єкти (бактерії, клітини тощо). Вони не
змінюють амплітуду світлових променів, що проходять крізь них, а здатні
змінити лише фазу останніх (світлові промені, що проходять крізь
щільніші ділянки препарату, дещо відстають за фазою від променів, які
проходять поряд). Однак відомо, що людське око не в змозі помітити
різницю між променями, які різняться лише за фазою.
З метою "перетворення" фазових об'єктів на амплітудні голландський
вчений Церніке (1934) запропонував спеціальну фазово-контрастну
мікроскопію.
Промисловість випускає фазово-контрастний пристрій КФ-4, яким
можна обладнати звичайний світловий мікроскоп і застосовувати фазово-
контрастну мікроскопію. Він включає фазово-контрастний об'єктив,
револьверний конденсор з діафрагмою, допоміжний мікроскоп. До
оптичної системи фазово-контрастного пристрою входять фазова
пластинка та кільцева діафрагма конденсора.
Фазова пластинка - це кружечок на одній із лінз об'єктива, напилений
солями рідких металів. Пластинка напівпрозора, змінює фазу світлової
хвилі на 1/4. Це й призводить до перетворення фазової різниці в
амплітудну. Кільцева діафрагма - непрозора пластинка, яка має лише
кільце, проникне для світлових променів.
З метою одержання фазово-контрастного ефекту необхідно, щоб кільце
фазової пластинки точно збігалося з кільцевою діафрагмою конденсора.