ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 18.07.2019
Просмотров: 2125
Скачиваний: 2
41
Цілість стерилізуючого фільтру повинна бути перевірена до
застосування і підтверджена одразу ж після використання відповідним
методом, таким як випробування на виникнення крапкових пухирців,
дифузного потоку або випробуванням під тиском.
При валідації слід встановити час, необхідний для фільтрації
відомого обсягу не розфасованого розчину, і різницю тиску по різні
сторони фільтру; будь-які суттєві відхилення від цих параметрів під час
рутинного ведення виробництва слід записувати і досліджувати.
Результати таких перевірок мають бути включені до протоколу серії.
Фільтр не повинен впливати на продукцію шляхом утримування її
інгредієнтів або виділення в неї речовин.
Стерилізація фільтрацією може бути виконана у вакуумних або
герметичних умовах. Розрізняють гідрофільні, гідрофобні, багаторазового
використання та одноразового (шприцеві) фільтри.
Використовують мембранні фільтри з поліпропілену, целюлози,
пористої нержавіючої сталі, запеченої тканини, проволоченої сітки,
мікроволокна, нейлона, емпрегнованої епоксидною смолою целюлози та
ін. Основні сучасні матеріали для виготовлення стерилізуючи мембран є
нейлон, фторпласт, полісульфон, ефіри целюлози. Матеріал мембрани
повинен бути сумісним з продуктом фільтрації. Продукт не повинен
змінювати фільтраційні властивості мембрани, а остання не повинна
виділяти у фільтрат будь-які речовини та сорбувати на собі речовини з
фільтрату.
Зараз широко застосовуються целюлозні та нітроцелюлозні
мембранні фільтри, які мають контрольований розмір пор (12-0,01 мкм,
іноді 5 нм). 65-80% поверхні фільтра мають 10
5
пор на см
2
.
Принципи проведення стерилізуючої фільтрації.
Система має бути максимально простою.
Розміри системи повинні забезпечувати обмеження потоку пре
фільтром перед стерилізуючою фільтрацією.
Стерилізуючий фільтр повинен бути вмонтований у кінцеву точку
системи.
Краще використовувати тиск (не вакуум).
Усі клапани поміщати перед фільтром.
Не використовувати сполучень з різьбою.
Проводити тест на цілісність системи до та після фільтрації.
42
Промивати обладнання зразу після використання.
Проводити фільтрацію у максимально чистих умовах..
Стерилізуючи фільтри стерилізуються шляхом автоклавуванням у
розібраному або повністю складеному стані на протязі 15 хвилин
при 121 °С. Якщо необхідно, після автоклавування фільтр збирають
в стерильних умовах ламінарного боксу.
БАКТЕРІАЛЬНИЙ
ТЕСТ
НА
ПІДТВЕРДЖЕННЯ
СТЕРИЛІЗУЮЧОЇ ФІЛЬТРАЦІЇ. У процесі фільтрації для отримання
стерильного продукту необхідно видалити усі бактерії з розчину. Для
проведення цього тесту повинна реалізовуватися найбільш складна
ситуація за умов 100% затримування. Для надійного проведення цього
тесту важливо, щоб тест-організм був найбільш стійким до обраної дії.
Наприклад, спори Bacillus strearothermophilus термічно стійкі та
використовуються для доведення надійності роботи автоклавів.
Під час фільтрації найбільш суттєвою характеристикою тест-
організму є його розмір. В якості такого організму був обраний
Pseudomonas diminuta АТСС 1914, якій має розмір ≈ 0,27 мкм.
Мікроорганізм повинен культивуватися в умовах, що зберігають
мінімальний розмір та сферичну форму, тобто використовувати мінімальну
кількість поживного середовища (сольового лактозного бульону) та не
струшувати культуру.
Важливо обрати оптимальну кількість тест-організму для перевірки
фільтру. Мала кількість мікроорганізму не дозволить перевірити кожну
пору, а надлишок призведе до утворення нещільного шару, якій буде
працювати як префільтр. Тому оптимальним є така кількість клітин, яка
утворить моношар, що вкриє усю поверхню фільтру - 10
7
організмів на 1
см
2
поверхні фільтра.
В результаті бактеріального тесту отримують кількісне значення для
стерилізуючого фільтра у логарифмах значення зменшення (LRV). LRV –
це десятковий логарифм відношення числа організмів, що потрапляють на
фільтр на 1 см
2
, до числа організмів, що пройшли через фільтр. Фільтр
вважається стерилізуючим якщо LRV≥7
на см
2
. Це значить, що при
потраплянні на фільтр 10
7
на см
2
Pseudomonas diminuta жоден з
мікроорганізмів не пройшов через фільтр.
43
КОНТРОЛЬ ЦІЛІСНОСТІ ФІЛЬТРІВ. Перевірка фільтрів на
цілісність базується на фізичних явищах, повязанних з процесом взаємодії
змоченої рідини та мембрани фільтру.
Дифузійний тест полягає у дифузії затиснутого газу через змочену
мембрану елемента фільтру. При цьому затиснуте повітря розчиняється у
рідині, що знаходиться у порах мембрани, та виходить на зворотній
стороні фільтру. Під величиною дифузії розуміємо певний заданий об‘єм
газу, який потрібний для компенсації втрат газу у наслідок дифузії для
підтримування постійного тиску. У пошкодженому фільтрі величина
дифузії значно перевищує цей параметр для даного типу фільтрів. У якості
змочувальної рідини для гідрофільних фільтрів застосовується вода, а для
гідрофобних – органічні розчинники (етиловий та ізопропіловий спирти)
або їх суміш з водою. У якості газу для тесту використовують затиснуте
повітря або азот.
Тест втрати тиску перевіряє герметичність фільтраційної системи
за втратою тиску за певний проміжок часу.
Тест на точку пухирця - це поступове підвищення тиску у системі
до утворення постійного повітряного потоку. Тиск при якому відбувається
вичавлювання води із пори фільтру та утворення постійного повітряного
потоку і називається точкою пухирця.
ЗАВДАННЯ.
1. Провести стерилізуючу фільтрацію сироватки крові за допомогою
одноразового шприцевого фільтру.
Лабораторна робота № 8.
УМОВИ
КУЛЬТИВУВАННЯ
ВИРОБНИЧИХ
ШТАМІВ
Мета- опанувати методи культивування виробничих штамів у різних
умовах культивування.
44
Культивування є основною стадією технологічного процесу
мікробного синтезу. Воно визначає кількісні та якісні характеристики
виробництва біопрепаратів.
Під час культивування отримують біомасу та продукти
метаболізму, які накопичуються у середині клітини та у культуральній
рідині.
Ферментація – сукупність послідовних операцій від внесення у
підготовлене середовище посівного матеріалу і до завершення процесу
росту клітин або біосинтезу цільового продукта.
Культуральна рідина - складна суміш, яка утворюється після
закінчення ферментації і складається з клітин продуценту, розчину
невикористаних поживних компонентів і продуктів біосинтезу.
Культивування вимагає оптимізації таких параметрів:
Температура (інтервал робочих Т коливається 25-60
о
С, точність до 1
о
С);
рН ( від 2до 9, з точністю до 0,2 рН);
спосіб перемішування;
концентрацію кисню для аеробів (розхід повітря від 0,15-до 2,5 м
3
/ м
3
середовища /хв);
стерильність;
запобігання
розповсюдженню
мікроорганізмів-продуцентів
у
зовнішнє середовище;
час культивування (для отримання біомаси -24 год, первинних
метаболітів – 48-72 год, вторинних 72-144год);
Як правило оптимальні умови культивування змінюються при кожному
десятикратному збільшенні об‘єму біореактора.
Промислова ферментація процес багатоступеневий.
Процедура розпочинається з виготовлення та стерилізації
культурального середовища та обладнання.
Спочатку вирощують висхідну культуру (5-10 мл).
Потім інкубують її у колбі, яку струшують (200-1000мл).
Після цього її переносять у ферментер для посівного матеріалу (10-
100л).
Потім у промисловий ферментер (1000-100000 л).
Збір матеріалу.
45
Якщо продукт локалізований всередині клітини, останні руйнують та
видаляють.
Якщо продукт секретується, його виділяють безпосередньо з
середовища.
ПРОМИСЛОВЕ
КУЛЬТИВУВАННЯ
МІКРООРГАНІЗМІВ
РОЗРІЗНЯЮТЬ:
1. ПОВЕРХНЕВЕ- вирощування промислової культури на
середовищі, яке містить тверді частки субстрату. Культивування
відбувається у кюветах, які виготовлені з оцинкованої жесті або
нержавіючої сталі з перфорованим дном. Заповнені поживним
середовищем кювети розміщують на етажерках з невеликим нахилом.
Кювети об‘єднують у касети. Цей спосіб не є ефективним і
використовується у разі відсутності альтернативного способу
культивування. Використовується для отримання деяких ферментів з
грибів-продуцентів, які культивуються на нестандартній сировині –
відходах, наприклад, пшеничні висівки для отримання протеаз і амілаз,
солодові паростки для отримання вітамінів та амінокислот.
Поверхневе культивування буває:
твердофазне – мікроорганізми ростуть на поверхні
щільного середовища.
Рідке – мікроорганізми ростуть на поверхні рідкого
поживного середовища.
2. ГЛИБИННЕ – мікроорганізми розподіляються у всьому
об‘ємі, а компоненти поживного середовища надходять в
результаті аерації та перемішування. Це більш ефективний вид
ферментації, дозволяє виробляти на одиницю часу та об‘єму
більшу кількість цільового продукту.
За режимом культивування буває:
ПЕРІОДИЧНИМ – мікроорганізми вирощують у стерильних
умовах без додавання свіжого культурального середовища. Періодичне
культивування залежить від кінетичної кривої росту мікроорганізмів:
Лаг-фаза – клітини адаптуються до нових умов (рН, концентрація
поживних речовин). Ця фаза спостерігається кожен раз, якщо посівний
матеріал отриманий з культури у стаціонарну фазу. Тривалість лаг-фази
залежить від часу знаходження у стаціонарній фазі і від відмінностей
попереднього і нового середовища.