ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 18.07.2019
Просмотров: 2123
Скачиваний: 2
56
УЛЬТРАЗВУКОВІ ДЕЗІНТЕГРАТОРИ. До основних позитивних
особливостей ультразвукової дезінтеграції мікроорганізмів слід віднести
зручність та відносну легкість організації процесу. Ультразвуковий вплив,
що призводить до руйнування мікробної оболонки, обумовлений
різноманітними фізичними та фізико-хімічними явищами кавітаційної
природи.
Кавітація – утворення та ріст газових пухирців у рідинах,
насичених звуковим полем. Рух пухирців з різною швидкістю
супроводжується фізичними ефектами (взаємозв‘язок високо градієнтних
потоків, ударних хвиль, локальних
стрибків тиску та температури,
збудження
люмінесценції,
народження вільних радикалів).
Лабораторні
ультразвукові
дезінтегратори мікроорганізмів –
прилади
універсального
призначення
з
потужністю
випромінювання
ультразвукових
коливань до 150 Вт. Мають змінні
робочі наконечники, різноманітних
форм та розмірів. Змінні камери,
об‘ємом від 1-100 см
3
, мають індикатори, регулятори, стабілізатори рівня
випромінювання потужності.
РУЙНУВАННЯ КЛІТИН МЕТОДОМ ЕКСТРУЗІЇ.
Екструзія – руйнація клітин за рахунок взаємодії їх з однорідним
рухомим середовищем під час виникнення градієнтів швидкості та
неоднорідного розподілення тиску. Екструзії може піддаватися рідке та
тверде середовище (заморожені суспензії).
Промислові дезінтегратори мікроорганізмів – це автоматизована
дезінтеграційна установка з потужністю кільцевого випромінювача до 1
кВт. Призначений для виробництва ветеринарних вакцин на біофабриках.
Регуляція протоку та температури біомаси автоматична.
57
Після руйнування тканин отримують гомогенат, після руйнування
клітин отримують лізат, після його центрифугуванням та осадження
нерозчинного матеріалу отримують екстракт. При отриманні екстракту
втрати білка (ферменту) за рахунок утримування рідини осадом не повинні
становити 20 %. Бактерії, дріжджі та подібні до них гриби з товстою
клітинною стінкою дають осад, об‘єм якого практично дорівнює
первинному об‘єму клітинного матеріалу. Це впливає на кількість
буферного розчину, якій треба додавати.
ЕНЗИМАТИЧНІ
МЕТОДИ
РУЙНАЦІЇ
КЛІТИН
МІКРООРГАНІЗМІВ. Прикладом дезінтеграції за допомогою ферментів
бактеріальних клітин є руйнування бактеріальної маси E.сoli лізоцимом
яєчного білка:
1. Добову культуру E.сoli на агарі змивають 1мл буферу.
2. До суспензії клітин додають екстрагуючий буфер (20 мМ
фосфатносольовий буфер, рН 7,0 + 1 мМ ЕДТА), якій містить 0,2
мг/мл
лізоцима
яєчного
білка
та
10
мкг/мл
0,3М
дезоксиробонуклеази.
Обробка
отриманого
екстракту
дезоксирибонуклеазою поліпшує його якість, завдяки зменшенню
в’язкості рідини.
3. Суспензію клітин з буфером перемішують 15 хв при 37
о
С
4. Суспензію клітин центрифугують при 15000g 20 хв.
ЗАВДАННЯ.
1.
Зруйнувати бактеріальну масу за допомогою ультразвукового
дезінтегратора.
2.
Зруйнувати бактеріальну масу ензиматичним методом.
Лабораторна робота №2
ОСНОВНІ
МЕТОДИ
ФРАКЦІОНУВАННЯ
І
ОЧИСТКИ БІЛКІВ
Мета: опанувати метод очищення білка шляхом висолювання.
58
ОЧИЩЕННЯ
БІЛКІВ
ШЛЯХОМ
ВИСОЛЮВАННЯ.
Висолювання білків пов‘язано з розчиненням солей у розчині, якій містить
білки. При цьому важлива природа солі. За здатністю до висолювання
аніони солей розміщуються у ряд Гофмейстера: SCN
-
, I
-
, ClO
4
-
, NO
3
-
, Br
-
, Cl
-
,CH
3
COO-, SO
4
2-
, PO
4
3-
. Щодо ефективності дії катіонів на осадження
білків, то моновалентні іони можна розмістити так: NH4
+
>K
+
>Na
+
.
При виборі солі необхідно враховувати ціну чистого препарату,
розчинність та особливості, пов‘язані з нагріванням розчину. Сіль амонію
сульфат має усі переваги та не має недоліків при роботі з типовим білком ,
окрім випадків коли треба працювати при високих рН. Розчинність
(NH
4
)
2
SO
4
мало змінюється у діапазоні 0-30
о
С, концентрація насиченого
розчину у воді становить 4 М. Щільність цього розчину становить 1,235
г*см
-3
, а щільність білка дорівнює 1,29 г*см
-3
. Кількість солі, яку треба
додати для отримання необхідної концентрації можна порахувати за
допомогою формули, а можна знайти у таблицях. Краще всього працювати
при нейтральних значеннях рН (6,0 – 7,5). Фракціонування (NH
4
)
2
SO
4
має
важливу перевагу – він призводить до стабілізації білків. Суспензія
білкового осаду у 2 – 3 М розчині (NH
4
)
2
SO
4
стабільна протягом років. Це
звичайний
метод
збереження
комерційних
препаратів.
Висока
концентрація солі попереджає протеоліз та дію бактерій.
У
багатьох
випадках
після
фракціонування
(NH
4
)
2
SO
4
використовують більш складні методи – іонообмінну або афінну
хроматографію.
Приготування насиченого розчину сульфату амонію. 800,0 г
реактиву амонію сульфату вільного від домішок металів додають до 1000
мл дистильованої води при 35
о
С, постійно струшуючи протягом 2 годин
(за допомогою шуттеля). Після чого температуру знижують до +4
о
С
(залишають на ніч у холодильнику). Оскількі деякі партії амонію
сульфату мають кислу реакцію слід довести рН розчину до нейтрального
значення слабким розчином аміаку. З цією метою невелику кількість
насиченого розчину розвести у 20 разів дистильованою водою та виміряти
рН (якщо міряти концентрований розчин, то можна помилитися більш
ніж на 1 ОД рН). Готовий препарат можна зберігати протягом року.
Діаліз. Концентрування білкових розчинів та діаліз тісно пов‘язані
між собою.
59
Діаліз – це процес видалення низькомолекулярних речовин, який
базується
на
здатності
напівпроникних
мембран
пропускати
низькомолекулярні речовини та іони.
При діалізі небажані низькомолекулярні речовини видаляються із
зразка та заміщуються буферним розчином. Під впливом високої
концентрації солі або органічної речовини, яка присутня у зразку, вода
починає входити у діалізний мішок раніше ніж сіль виходити з нього.
Діалізні трубки не пропускають молекули більші за 15000-20000 Да. Усі
низькомолекулярні речовини вільно проходять через мембрану поки склад
буфера з обох сторін не вирівняється. Треба враховувати, що під час
діалізу може проходити протеолітичне розщеплення білків. Для повного
виділення із зразка ендогенної солі необхідно замінювати буферний
розчин як мінімум 2–3 рази, а об‘єм буфера повинен бути у 1000 разів
більшим ніж об‘єм діалізату.
Підготовка діалізних мішків
1.Взяти з упаковки суху діалізну трубку та відрізати її необхідного
розміру;
2. Відрізану діалізну трубку зволожити дистильованою водою;
3. Після зволоження трубки з одного кінця зав’язати два вузла (можна
зберігати у стерильній дистильованій воді 1–2 дні);
4. Вологий діалізний мішок прокип’ятити у розчині 2 %-го натрію
бікарбонату (якщо планується використовувати для нуклеїнових кислот
слід додати 1мМ ЕДТА, якій зв’язує солі Mg);
5. Діалізний мішок промити у дистильованій воді (не підсушувати);
6. Підготовлений діалізний мішок можна зберігати у дистильованій воді
не більше 4 годин.
Фракціонування нативної сироватки насиченим розчином
амонію сульфату
1.Осадження матеріалу слід проводити на холоді при О
о
С (у чашці з
льодом). До 10 мл нативної сироватки ВРХ у центрифужній пробірці
(загальний об’єм 25 мл) додати по краплях 5 мл насиченого розчину
(NH
4
)
2
SO
4.
Після додавання кожних 0,5 мл реактиву пробірку ретельно
60
струшують. Осад повинен зникати, поки об’єм реактиву не досягне 3
мл.
2. Після повного внесення реактиву матеріал залишити на 12 годин при +4
о
С.
3. Осаджений матеріал у пробірці слід піддати центрифугуванню при
3000 об/хв. 20 хв.
4. Супернатант (надосадова рідина) відсмоктати піпеткою та
видалити.
5 До осаду додати розчин(NH
4
)
2
SO
4
33 % насичення, розмішати.
6. Матеріал у пробірці слід піддати центрифугуванню при 3000 об/хв. 20
хв.
7. Супернатант (надосадова рідина) відсмоктати піпеткою та видалити
8. Осад суспендувати у3 мл 0,9 %-го розчині NaCl.
9.Матеріал внести у підготовлений діалізний мішок. З цією метою у
відкритий кінець діалізного мішка вставити скляну лійку, через яку у
мішок налити матеріал. Його зручно наливати, коли один кінець діалізного
мішка лежить на площині.
10. Діалізний мішок з матеріалом зав’язують бавовняною білою ниткою. У
мішку слід залишити вільний простір з розрахунку на збільшення об’єму,
якщо концентрація розчинених у зразку речовин висока. Якщо цього не
зробити при збільшенні об’єму розчину тиск всередині мішка сильно
виросте і мішок розтягнеться. Це може призвести до розриву мембрани
або витіканню розчину через вузли.
11.Діалізний мішок з матеріалом помістити у плоскодонну колбу з
буферним розчином (кількість розчину розраховується із співвідношення
матеріал/ діалізний буфер як 1:10000) та магнітом. Колбу поставити на
магнітну мішалку на середні оберти, щоб не утворювалося піни під час
перемішування (ознака денатурації білка). Загальний час діалізу
становить 48 годин.
12. Через 12 годин буфер у колбі обережно замінити. Провести діаліз 12
год при +4
о
С
13. Див. пункт 12
14. Див. пункт 12.
15. Після закінчення діалізу вміст мішка обережно вилити у пробірку.
Перевірити повноту діалізу за допомогою розчину барію хлористого. З
цією метою в окремому флакончику до невеликої кількості діалізату