ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 18.07.2019
Просмотров: 2119
Скачиваний: 2
61
додати 1М BaCl
2
(у випадку неповного очищення матеріалу від амонію
сульфату випадає осад барію сернокислого BaSO
4
).
16. Матеріал зберігати у холодильнику для подальших маніпуляцій.
17. Визначити концентрацію очищеного білка.
Визначення концентрації білка біуретовою реакцією
1. Приготування біуретового реактиву. Розчиняють 1,5 г CuSO
4
*5H
2
O та 6,0 г тартрата калія та натрія у 500 мл води. Додають 300 мл
10 %-го NaOH та доводять водою до об’єму 1000 мл.
2. Визначення концентрації білка. До 0,5 мл розчина білка невідомої
концентрації (до 3 мг) додають 2,5 мл біуретового реактиву. Розчин
витримують 20 хв. Вимірюють оптичну щільність при 540 нм.
Визначення концентрації білка реакцією Лоурі
1. Приготування реактивів
Реактив А. Розчиняють 0,5 г CuSO
4
*5H
2
O і 1,0 г натрію цитрата у 100
мл води. Цей розчин стійкій та зберігається тривалий час.
Реактив В. 20,0 г Na
2
CO
3
та 4,0 г NaOH розчиняють у 1 л води.
Реактив С. До 50 мл реактиву В додають 1 мл реактиву А.
Реактив D.До 10 мл реактива Фоліна–Чіокалтеу (готовий реактив
замовляється) додають 10 мл води.
2. Визначення концентрації білка. До 0,5 мл розчину білка невідомої
концентрації (не більше 0,5 мг) додати 2,5 мл реактиву С, перемішати та
залишити на 10 хв. Додати 0,25 мл реактиву D. Розчин ретельно
перемішати та залишити на 20 хв. Після появи зафарбування вимірюють
оптичну щільність при довжині хвилі між 600–750 нм.
ЗАВДАННЯ.
1.
Провести висолювання білків сироватки крові.
62
Лабораторна робота 3.
ХРОМАТОГРАФІЧНІ
МЕТОДИ
ФРАКЦІОНУВАННЯ БІОМОЛЕКУЛ
Мета: опанувати метод хроматографічного фракціонування
біомолекул за допомогою колонкової хроматографії.
Розділення білків проводять шляхом осадження, у розчині та шляхом
адсорбції.
Серед лабораторних методів очистки, фракціонування та аналізу
структури білків, нуклеїнових кислот та їх компонентів сукупність різних
хроматографічних методів займає центральне місце. Жоден інший метод
не може порівнятися з хроматографією за широтою кількісного діапазону.
Починаючи з препаративних колонок об‘ємом у декілька літрів (на них
можна вести фракціонування препарату кількістю декілька грамів) до
мікроаналізу амінокислотного складу білка, коли на колонку вносять соті
долі
мікрограма
гідролізату.
Поза
конкуренцією
залишається
різноманітність фізико-хімічних параметрів, за якими проводиться
хроматографічне фракціонування.
Термін хроматографія (від грец. сhroma – колір і grapho- пишу)
вперше було використано для опису розділення природних пігментів у
результаті різного ступеня їх затримки на фільтрувальному папері. Цей
принцип розділення було названо одномерною хроматографією, який зараз
широко використовується. Хроматографія базується на тому, що розчинені
речовини відстають від фронту розчинника по мірі його проходження по
носію. Для проведення хроматографії можна використовувати колонки з
носіями (що може бути прирівняне до стопки фільтрувального паперу).
Тепер зразок на старті являє собою диск або циліндр, а не тонку лінію. По
мірі проходження розчинника по колонці, речовини, які є у зразку,
розподіляються залежно від ступеня розчинення. Речовини повністю
виділені розчинником, рухаються разом з фронтом розчинника (Rf=1) і
вимиваються першими. Речовини, які повністю адсорбувалися носієм
(Rf=0) залишаться на старті. Хроматографія можлива лише за умови
63
0≤Rf≤1, коли речовина затримується в результаті часткової адсорбції, але
пізніше обов‘язково елююється (виділяється).
Хроматографічні методи об‘єднує в одну категорію одна принципова
особливість - у будь-яких підходів можна виявити двофазну систему, у
якій одна фаза не рухома, а інша переміщується відносно неї з деякою
швидкістю у одному визначеному напрямку.
Не рухома фаза залишається незмінною, заповнюючи порожнину
трубки (хроматографічної колонки) або фіксуючись на поверхні скляної
або пластикової пластинки (інколи її основу утворює фільтрувальний папір
або плівка ацетилцелюлози).
Рухома фаза безперервно оновлюється, вона поступає у систему з
одного кінця і залишає її з іншого. Молекули компонентів висхідної
суміші речовин розподіляються між двома фазами відповідно до ступенів
їх спорідненості до них. На кожній ділянці нерухомої фази цей розподіл
намагається досягти динамічної рівноваги, яка безперервно порушується
внаслідок переміщення рухомої фази.
У результаті постійного перерозподілу молекул речовини між
фазами мігрують у напрямку руху рухомої фази. Розподіл між фазами
перебігає незалежно для кожного компоненту суміші речовин. Якщо
спорідненість молекул компонентів суміші до двох фаз не однакова, тоді ці
молекули мігрують у напрямку рухливої фази – впродовж шляху
хроматографічного розподілу (впродовж колонки) з різною швидкістю, що
дозволяє фізично відокремити ці компоненти.
Не рухома фаза може бути : рідкою та твердою.
Рухлива фаза може бути: рідкою та газовою.
Для очистки та фракціонування білків, нуклеїнових кислот та їх
компонентів використовується переважно рідинна хроматографія.
Варіанти рідинної хроматографії різняться за природою споріднення
молекул які фракціонуються до хроматографічних фаз, тому
хроматографію класифікують за принципом фракціонування.
64
КЛАСИФІКАЦІЯ ХРОМАТОГРАФІЧНИХ МЕТОДІВ ЗА
ПРИНЦИПОМ ФРАКЦІОНУВАННЯ
1. Гель-фільтрація
Гель-фільтрація є одним з важливих методів очищення ферментів, якій
відрізняється більш м‘яким розділенням білків. У цьому варіанті
хроматографії молекули речовини, яка фракціонується не повинні
володіти ніяким спеціальним спорідненням до нерухомої або рухливої фаз.
Нерухома фаза представлена рідиною, яка знаходиться всередині пористих
гранул. Ця рідина ідентична рідині рухомої фази, яка перебігає між цими
гранулами. У більшості випадків використання гель-фільтрації для
біологічних цілей робочою рідиною є водносолеві розчини, а матеріали
гранул гідрофільні.
Перехід молекул речовини з рухомої фази у нерухому та навпаки за
рахунок дифузії нічим не стримується. Проте у середині гранул дифузія
утруднена через зштовхування молекул речовини, які дифундують з
нитками просторової сітки полімеру або стінками пор.
Якщо у складі є великі молекули, які не проходять у пори гранул, то
вони будуть виходити з колонки з переднім фронтом рухомої фази. Якщо є
дрібні молекули, які вільно дифундують всередину гранул, то вони
частину часу будуть знаходитися у нерухомій фазі. Статистично ця
частина часу однакова для усіх молекул такого розміру та залежить від
співвідношення об‘ємів рідини у нерухомій та рухомій фазах. Таким
чином усі дрібні молекули досягнуть кінця хроматографічного шляху
майже одночасно та пізніше ніж великі молекули. Це явище було названо
«гель-фільтрацією» тому, що як просторову сітку використовували
агарозні гелі. Однак ці гелі дуже легко деформуються та для хроматографії
під тиском не придатні, тому їх замінюють на пористе скло та селикагель.
Широко застосовуються гелі – сефадекси, за допомогою яких можна
швидко розділити макромолекули відповідно до їх розмірів.
2. Розподільча хроматографія
Це хроматографічний процес, у якому нерухома та рухома фази
представлені двома рідинами, які або не змішуються або змішуються
частково. Якщо у цих двох рідинах, які контактують між собою розчинити
одну речовину то концентрація цієї речовини буде однакова у цих
розчинниках лише за умови, що вони мають однакову розчинну здатність
65
відносно до цієї речовини. Якщо ж вони мають різну розчинну здатність,
тоді молекули речовини будуть переходити з однієї рідини у іншу доти,
поки не встановиться рівновага, при якій висока концентрація молекул
речовини буде у тій рідині, яка має більшу розчинну здатність.
Чим вище спорідненість компонента до нерухомої фази, тим
повільніше він мігрує впродовж колонки чи пластинки. Рідина нерухомої
фази, як і при гель-фільтрації, може бути просто іммобілізована всередині
пористих гранул або зв‘язана з волокнами целюлози, що набрякла, або
покривати плівкою гранули з суцільного матеріалу та поверхню пор у
середині.
Історично склалося, що «нормальним» розподілом фаз називають таке,
при якому нерухомою є водна фаза. За рахунок змочування (набухання)
вона
легко
фіксується
на
гідрофільних
матрицях
(целюлозі,
поліакриламідному або декстриновому гелях, діатомових землях,
силікагелі), а у склад рухомої фази тоді входять органічні розчинники.
Наприклад, у системі фенол-вода, білки переходять у фенол, а
полісахариди та нуклеїнові кислоти у воду.
При зворотному розташуванні фаз, коли на твердій матриці фіксують
плівку органічного розчинника, а рухома фаза є водним розчином,
розподільчу хроматографію називають хроматографією у зворотних фазах.
Гель-фільтрація та розподільча хроматографія належать до методів
розділення у розчинах.
3 Адсорбційна хроматографія
У цьому процесі нерухомою фазою є твердий сорбент. Чим більшу
спорідненість має до сорбенту даний компонент суміші, тим повільніше
він буде мігрувати за елюентом продовж колонки чи пластини.
4. Афінна хроматографія
Це особливий тип адсорбційної хроматографії. Афінність це міцність
(енергія) не ковалентних взаємодій між рецептором (антигензв’язуючим
центром антитіла) та лігандом (антигенною детермінантою). Адсорбція
проходить за рахунок біоспецифічної взаємодії між молекулами, які
закріплені на матриці (зв‘язані у нерухомій фазі) та комплементарними
молекулами (які треба очистити або фракціонувати), які надходять та
елююють з рухомою фазою.