ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 18.07.2019
Просмотров: 2114
Скачиваний: 2
71
Рис.1. Схема заповнення колонки. Суспензія сорбенту
безперервно перемішується у лійці (1), після осадження у
буфері (2) адсорбент (3) ущільнюється та затримується
диском з пористого скла (4),через який проходить
буферний розчин
Після утворення стовбура сорбенту заввишки 5–10 см,
кран відкривають так, щоб швидкість витікання рідини
становила 30–40 крапель за хвилину. Після повного
осадження суспензії слід пропустити буфер через колонку
ще декілька годин для її повного ущільнення та
зрівноваження. Потім на поверхню стовбура сорбенту
поміщують диск фільтрувального паперу.
Хроматографію білків, як правило, проводять на
холоду, в спеціально обладнаних приміщеннях при
температурі 4–6
о
С. Фракції білка збирають вручну або
автоматично.
Концентрацію
білка
вимірюють
за
допомогою спектрофотометра (при довжині хвилі 280
мкм) або за допомогою приладу типу Uvicord (LKB,
Швеція).
Очищення γ-глобуліна за допомогою колонкової іонообмінної
хроматографії на ДЕАЕ-целюлозі
1. Підготовка іонообмінника. Залити 50,0г порошку ДЕАЕ-целюлози
1000 мл дистильованної води для набухання. Після того як більша частина
порошку посяде, відсмоктати надосадову рідину з неосадженими
частками порошку (вони забивають колонку та різко знижують
швидкість протікання розчинника). Осад знову підіймають у
дистильованій воді та після осадження декантують.
2. Підготовка колонки. Якщо не має справжньої колонки, взяти скляний
або пластмасовий медичний шприц на 20 мл. Виміряти розмір колонки (h-
висота,d-діаметр,v-обєм).
2.1. Закріпити колонку вертикально на штативі.
2.2. На дно колонки помістити диск з паперу завтовшки 3 мм (ватман)
72
2.3. Заповнити колонку іонообмінником – ДЕАЕ-целюлозою. Для цього
целюлозу у склянці промити Н
2
О dest. та заповнити колонку при
постійному перемішуванні.
При закритому крані колонки суспензія іонообмінника поступово
осідає. Після повного осадження суспензії з метою ущільнення
іонообмінника через колонку слід пропустити 100 мл буфера.
2.4.Після заповнення колонки на поверхню сорбенту викласти
паперовий диск (см. пункт 2.2.)
2.5. Урівноважуємо колонку. Пропустити 0,5 М NaOH. Вихід NaOH
контролювати індикаторним папером. Для визначення об’єму NaOH,
необхідного для активації колонки, слід зробити розрахунки за формулою:
S=πr
2
h де, π –3,14, r– внутрішній радіус колонки, h–висота
іоннообмінника
Наприклад S=3,14*0,752*19,5=35 мл – це один об’єм NaOH.
2.6. Після проходження 1–2 об’ємів NaOH, колонку промити Н
2
О dest. до
рН 8,0-8,5.
2.7.Пропустити 1–2 об’ємів 0,5 М HCl, після чого промити Н
2
О dest. до рН
6,0.
2.8. Пропустити через колонку 3–4 об’єми 0,02 М фосфатного буфера, рН
6,35. Швидкість протікання 10–15 крап/хв.
3. Проведення колонкової хроматографії.
3.1. Повністю відсмоктати буфер на поверхні іонообмінника у колонці.
Досліджуваний матеріал (сироватка кроля оброблена (NH
4
)
2
SO
4
після
діалізу, см. тема №1) внести на колонку з ДЕАЕ-целюлозою. Білок
нашаровувати обережно та дати йому всмоктатися.
3.2. Пропустити через колонку 0,02 М фосфатний буфер, рН 6,35 зі
швидкістю протікання 10–15 крап/хв.
3.3. Елюат збирати у флакони по 5 мл. Хроматографію білків слід
проводити на холоді (+4+6
о
С).
3.4. Концентрацію білка у фракціях визначити за допомогою
спектрофотометра (за поглинанням при 280 ммк) або безперервно на
приладі типу Uvicord.
3.5. Після закінчення хроматографії матеріалу перекрити кран
колонки.
3.6. Іонообмінні целюлози можуть бути використані багаторазово. З
цією метою після кожного експерименту іонообмінник треба
73
регенерувати- пропустити через колонку 0,5 М NaOH, що забезпечує
практичне повне видалення зв’язаного з іонообмінником білка. Після чого
целюлозу промити дистильованою водою до повного видалення лугу. Після
урівноваження ДЕАЕ-целюлози відповідним буфером вона може бути
використана вдруге. З часом емність іонообмінників знижується
внаслідок руйнації частини іоногенних груп. Тому регенерацію можна
проводити не більше 6–8 разів
ЗАВДАННЯ.
1. Зібрати та підготовити колонку для проведення іонообмінної
хроматографії висолених білків сироватки крові.
Лабораторна робота №4.
ЗБЕРІГАННЯ БІОПРЕПАРАТІВ
Мета: Опанувати методику підготовки до ліофілізації білоквмісної
рідини.
Матеріал біологічного походження надзвичайно нестійкий, тому
потребує стабілізації та консервування. В звичайних умовах тривалість
збереження більшості біологічних продуктів досить обмежена (декілька
діб). Тому були запропоновані різні способи консервування біопрепаратів:
1.
КОНСЕРВУВАННЯ ХІМІЧНИМИ РЕЧОВИНАМИ
(глицерін, формалін, фенол, хлороформ, мертіолят натрію). Консервування
деякими хімічними речовинами, нажаль, призводить до незворотних
перетворень і, у більшості випадків, не є придатними для консервування
живих клітин та мікроорганізмів.
2. КОНСЕРВУВАННЯ
НИЗЬКИМИ ТЕМПЕРАТУРАМИ
(охолодження та заморожування). Консервування низькими температурами
досить розповсюджений метод стабілізації біологічних препаратів та
добрий метод зберігання живих клітин, мікроорганізмів та вірусів. Проте,
він не достатньо підходить для тривалого зберігання готових біологічних
препаратів, вимагає спеціальних умов транспортування та зберігання.
74
3.
КОНСЕРВУВАННЯ ЗНЕВОДНЕННЯМ. Консервування
зневодненням або висушуванням є найбільш досконалим з запропонованих
методів стабілізації продуктів біологічного походження та дозволяє
зберігати продукти в звичайних умовах тривалий час. Під час висушування,
крім того, знижується вага продукту, що дозволяє економити на упаковці та
транспорті.
Зневоднення – технологічний процес, різноманітний комплекс
теплових, дифузійних, біологічних та хімічних явищ.
Препарати біологічного походження являють собою складні об‘єкти
висушування та характеризуються низкою показників:
початкова вологість
кінцева вологість
рівно вагова вологість
термічні характеристики
електро-фізичні характеристики
массообмінні характеристики
Усі продукти біосинтезу по відношенню до процесу висушування
умовно поділяють на два класи:
1. Продукти, що під час зневоднення потребують збереження
життєздатності клітин або їх високої активності (антибіотики,
ферменти, вакцини).
2. Продукти, які після висушування повинні зберігати свої
біологічні властивості (компоненти сухих поживних речовин,
сухі поживні середовища).
На даний час з відомих апаратів для висушування використовуються:
1. сушильні
апарати
з
дисковим
та
форсуночним
розпилювачем,
2. вальцеві сушильні апарати
3. Сублімаційні сушильні апарати.
Препарати біологічного походження складні за своїм складом. Вони
містять біологічно активні компоненти, органічні сполуки і велику
кількість води. Вологі матеріали в залежності від форм зв‘язку та кількості
вологи, що поглинулася, поділяють на:
1. Колоїдні;
2. Капілярно-пористі;
3. Капілярно-пористі колоїдні тіла.
75
Одним з основних параметрів, що характеризує взаємодію води з
матеріалом, є енергія зв‘язку. Це робота, яку необхідно провести для
виділення з матеріалу одного моля води при постійній температурі.
Чим міцніший зв'язок води з матеріалом, тим менший парціальний
тиск рівно вагового пару над матеріалом.
Вода у продуктах біосинтезу може знаходитися як у вільному так і у
зв’язаному станах. Міцність зв‘язку вологи з матеріалом залежить від
природи субстрату та впливає на собівартість та кінетику процесів
висушування.
У біологічних матеріалах значна частина води утримується у
субстраті фізико-хімічними зв’язками. Усі форми зв‘язування вологи з
матеріалом поділяються на три групи:
1. Вода зв’язана хімічно – вода, яка зв‘язана з матеріалом
надміцним хімічним зв‘язком. Вода може бути видалена лише
під дією хімічних реакцій або інтенсивному тепловому
обробітку. Як правило, під час висушування хімічно зв‘язана
вода не видаляється.
2. Вода зв’язана фізико-хімічним зв’язком - це волога, що
зв‘язана адсорбційно та осмотично. Адсорбційно зв‘язана
волога утримується на поверхні біологічних макромолекул
ван-дер-ваальсовими силами. Ця вода міститься у цитогелю та
енергія її зв‘язку невелика.
3. Вода, зв’язана фізико-механічним зв’язком – вода, що
знаходиться у порах та капілярах матеріалу.
За іншими пропозиціями, воду поділяють на вільну та зв’язану.
Молекули вільної води слабко взаємодіють з молекулами матеріалу та
відокремлені від останнього шаром молекул зв‘язаної води. Вільна вода
володіє якостями звичайної рідини. Задля видалення зв‘язаної води
потрібна температура та вакуум більші за аналогічні під час видалення
вільної води. Залишкова волога у сухих біопрепаратах має складати не
більше 1-3% та являє собою міцно зв’язану воду, яка забезпечує
стабільність їх структури.
Метод висушування залежить від:
1. Кінцевої кількості вологи у готовому препараті
2. Характеристики сировини, що висушується.