ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 18.07.2019
Просмотров: 2116
Скачиваний: 2
16
Лабораторна робота №3.
СЕЛЕКЦІЯ ШТАМІВ ДЛЯ СТВОРЕННЯ
СУПЕРПРОДУЦЕНТІВ ТА ВАКЦИННИХ ШТАМІВ.
Мета: навчитися виділяти штами-мікроорганізми за селекційними
маркерами.
Усі процеси життєдіяльності мікроорганізму направлені на
безупинний ріст та поділ до тих пір, поки середовище буде містити
мінімальні умови для цього. Усі процеси у бактеріальній клітині
підпорядковані жорстким правилам економії. Жоден з первинних
метаболітів не утворюється більше необхідного. Для промислових завдань
генетична програма клітини повинна бути перебудована таким чином, щоб
спрямувати потенціал біосинтезу клітини не на самовідтворення, а на
виробництво необхідного продукту. Виділення та підбір об‘єкта –
важливий етап біотехнологічного процесу. Проте шляхом простого
підбору отримати високоактивні продуценти не вдається, тому стратегія
селекційної роботи з мікроорганізмами полягає у пошуку природних
форм, які володіють корисними якостями для людини (синтез цінної
сполуки, висока швидкість росту, здатність до засвоєння дешевих та
доступних матеріалів) та створенню на їх базі промислових штамів. Це
відбувається шляхом зміни регуляції метаболічної активності мікробної
клітини.
Методи сучасної селекції – це сукупність маніпуляцій, за
допомогою яких змінюють генетичну програму мікроорганізмів.
Генетичне конструювання in vivo – отримання та виділення
мутантів з використанням різних способів обміну спадковою інформацією
живих мікробних клітин.
Генетичне конструювання in vitro базується на використанні
генетичної інженерії (створення рекомбінантних ДНК). Проте, цей поділ
умовний, тому що методи взаємопов‘язані.
Виявити зміни генетичної програми мікроорганізму, отримані
незалежно яким конструюванням, можна лише за відбором мутантів.
Наприклад, щоб виявити колонію Lac
-
(нездатність зброджувати лактозу)
17
серед колоній E. coli дикого типу (Lac+) необхідно продивитися 100000
клонів.
Клон - (від грец. klon – гілка нащадків) – популяція клітин або
організмів, що походять від загального предка шляхом безстатевого
розмноження.
Коли неможливо провести прямий відбір мутантів, досліджують
колонії
на
індикаторних
чашках,
застосовують
тест-культури
мікроорганізмів, метод відбитків (реплік). За необхідністю вирощують
кожну окрему колонію та визначають у культуральній рідині активність
синтезованої речовини.
Метод індикаторних чашок полягає у вирощуванні окремих
колоній у чашках з середовищем з індикатором, якій виявляє різницю рН
між колоніями, які метаболізують або ні певні вуглеводи. Мутанти
різняться за коліром колоній та фенотипом (на агарі з трифенілтетразолієм
колонії, які не зброджують лактозу, набувають червоного коліру, а колонії
які зброджують залишаються незафарбованими). Інколи вносять
субстрати, які змінюють прозорість середовищ – навколо колоній мутантів
утворюються прозорі зони.
Метод тест-культур вимагає використання ауксотрофів та
чутливих до антибіотиків культур. Характеристику мутантів проводять за
зоною росту або пригнічення, а також структурою, формою та прозорістю
колоній. Отримання та вдосконалення штамів-продуцентів амінокислот
вимагає перевірки великої кількості мутантів. Ефективність селекції тим
вища, чим більший об‘єм матеріалу, що піддається відбору. Між тим під
час «відбору у ручну», коли виділяються окремі колонії та перевіряються в
умовах ферментації в колбах на гойдалках, вірогідність находження
високоактивних штамів обмежується кількістю матеріалу. Тому попередня
оцінка активності штамів-продуцентів амінокислот дозволяє виключити
заздалегідь безперспективні мутанти, і відповідно, скоротити кількість
варіантів, що потребують кінцевої перевірки.
Принцип дії методу тест-культур базується на явищі синтрофізму,
коли під час сумісного висіву на мінімальне поживне середовище навколо
колоній продуцентів утворюються зони росту мікробів, які потребують
відповідні амінокислоти. Розмір зон знаходиться у прямій залежності від
18
кількості амінокислоти, що синтезується. Колонії, що утворюють
найбільші зони, використовують для подальших перевірок за допомогою
більш складних та точних способів оцінки - ферментацією у колбах та
ферментерах. Для використання цього методу у селекції штамів-
продуцентів амінокислот необхідною умовою є наявність відповідних
тест-культур, ауксотроф них за певними амінокислотами.
Метод відбитків, запропонований Ледерберг Д, Ледерберг Е, 1952р.
Сутність методу полягає у відборі мутантів, що здатні рости на різних
середовищах:
1. Чашки Петрі із звичайним середовищем засівають культурою
мікроорганізму, таким чином щоб на ній виросло 50-200 колоній.
2. Стерильний оксамит або фільтровальний папір натягують на
металевий циліндр з діаметром, що відповідає чашці Петрі, та
закріплюють. Чашки з колоніями прикладають до поверхні оксамиту.
3. Потім до цього оксамиту з відбитками колоній прикладають чисті
чашки з різними середовищами.
4. Після культивування на них утворюються колонії у аналогічному
розташуванні. На чашках з мінімальними середовищами можна
виявити ауксотрофні мутанти. Різні модифікації цього метода
використовуються для виділення мутантів з поживними потребами, а
також мутантів чутливих до фізичних, хімічних та біологічних
факторів (температура, фаги, антибіотики).
Метод відбитків можна модифікувати застосуванням безпосередньо
у середовищі антибіотиків, які убивають ростучі клітини. Наприклад,
ауксотрофний мутант E. сoli за треоніном не росте на мінімальному
середовищі без треоніну. В таких умовах пеніцилін буде вбивати лище
прототрофні клітини. Якщо необхідна мутація виникла спонтанно з
частотою 10
-7
, тоді достатньо передивитися декілька тисяч колоній, які
вижили після обробки пеніциліном, щоб знайти колонію необхідної
мутації.
Якщо це стосується спороутворюючих мікроорганізмів, частку
ауксотрофних мутантів можна підвищити прогріванням культур, які
проростають у мінімальному середовищі. Прототрофи, які проростуть при
19
нагріванні загинуть, а ауксотрофи, які перебувають у вигляді спор,
виживуть та проростуть на збагаченому середовищі.
Міцеліальні гриби для виділення ауксотрофних мутантів
використовують метод збагачення при фільтруванні. Під час
культивування на мінімальних середовищах прототрофні клітини
поділяються та утворюють великі частки, які затримуються фільтром, а
клітини, які не діляться промиваються у фільтрат.
Ауксотрофні мутанти представляють значний інтерес для селекції
промислових мікроорганізмів. Наприклад, гомосеринові ауксотрофи
глутаматпродукуючих
коринеподібних
бактерій
Corynebacterium
glutamicum є ефективними продуцентами лізіну. Мутації ауксотрофності
можуть підвищувати вихід цілевого продукту, змінюючи регуляцію його
біосинтезу. Розповсюджений метод отримання продуктивних штамів –
виділення ауксотрофів та відбір псевдоревертантів, які несуть регуляторні
мутації. Ауксотрофні мутанти використовують під час отримання
рекомбінантних штамів у генетичних схрещеннях. Вміст мутантів у
мікробній популяції можна збільшувати шляхом мутагенезу. Вибір
мутагену визначається типом мутації, яку бажано отримати, а також
ефективність мутагену по відношенні до даного організму. Досягнення
молекулярної генетики дозволили проводити відбір продуцентів за
стійкістю їх до структурних аналогів цільового продукту. Метод
базується на регуляції ферментів за принципом зворотного зв‘язку
кінцевого продукту біосинтетичного шляху. Підвищення концентрації
метаболіту інгибує активність ферменту, який приймає участь у синтезі
метаболіту, або репресує синтез цього ферменту. Наприклад, за наявності
глюкози та NH
4
+
клітини багатьох бактерій синтезують усі необхідні для
життєдіяльності азотмісні сполуки. Якщо у середовище додати певну
амінокислоту, то її синтез швидко припиняється. В цих умовах
виживають лише де які клітини - мутанти з порушеною регуляцією
активності та синтезу ферментів. Бажані ті мутанти у яких фермент зберіг
функціональну активність, але втратив чутливість до інгибуючої дії
кінцевого продукту або його аналога. Синтез ферменту стійкий до
надлишку продукту або його аналога. Подібні мутації призводять до
20
появи зверхпродуцентів, які синтезують цільовий метаболіт у аномально
високих концентраціях.
Якщо необхідно досягти накопичення не кінцевого, а проміжного
продукту біосинтетичного шляху тоді використовують мутантів, у яких
заблокований наступний за інтермедіатом етап синтезу. Такий мутант
ауксотрофен - росте лише при додаванні у середовище культивування
речовини, яка є продуктом блокованої реакції.
В селекції продуцентів ферментів важливе значення має отримання
конститутивних мутантів. З цією метою можна використовувати
метаболізуючи аналоги субстратів, не здатних викликати індукцію. На
чашках, де такі сполуки є єдиним джерелом вуглецю та енергії
утворюються колонії лише мутантів, які синтезують відповдні ферменти
конституітивно.
Мутанти, стійки до пеніциліну, бацитрацину, поліміксину, ністатину,
кабіцидіну можуть бути селективно отримані на середовищах, які містять
інгибуючи концентрації цих антибіотиків. В них часто спостерігається
зміна проникності клітинної мембрани, яке підвищує їх продуктивність.
Так, стійки до пеніциліну мутанти Cor. glutamicum продукують на 15-20%
більше лізину, ніж висхідні чутливі штами. Мутанти Cephalosporium
acremonium стійкі до ністатину, кабіцидину виділяють у середовище
більше 10 г/л цефалоспорину С. Мутанти Trichoderma reesei стійкі до
кабіцидіну секретують підвищену кількість целюлози.
ЗАВДАННЯ.
1. Відібрати клони на різних чашках (наприклад, відбір клонів, що
синтезують α- інтерферон).