ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 18.07.2019
Просмотров: 2120
Скачиваний: 2
31
7.
Розливання. Середовище розливають у скляні пляшки
об‘ємом у 2-3 рази більшим ніж об‘єм середовища. Усі пляшки з
середовищем обов‘язково маркують (підписують водостійким маркером
назву та дату виготовлення середовища).
8.
Стерилізація. Середовища стерилізуються залежно від
складу в умовах автоклаву, кип‘ятінням або фільтрацією.
Таблиця 1.
Деякі можливі відхилення, що виникають під час приготування
поживних середовищ
Параметри
відхилення
Причини виникнення відхилень
Відхилення рН
Перегрів,
неповне
перемішування,
тривала
стерилізація,
використання
лужного
скла,
неочищена вода, розплавлення вдруге, гідроліз
інгредієнтів, тривале збереження в умовах високих
температур (≥25
0
С).
Неповне розчинення
Відхилення від інструкції з нагріву агаризованого
середовища, неповне перемішування, мала ємність
для приготування середовища (осад може бути
важливим компонентом середовища, як наприклад у
вісмут-сульфіт агарі)
Потемніння
Перегрів середовища, погане перемішування,
недостатня кількість води для розчинення.
М’який гель
Неповне
розчинення
агару,
недостатнє
перемішування,
недотримання
інструкції
по
відновленню сухого середовища, кислотний гідроліз
агару, надмірне розведення сухого середовища.
Втрата ростових та
диференціюючих
властивостей
Повторне плавлення, надмірне нагрівання, неповне
перемішування,
надмірне
розведення
сухого
середовища, невідповідний розчинник та ін.
Нехарактерний колір
середовища
Непридатність сухого середовища, неякісний посуд
(залишки миючих засобів), неочищена вода.
Токсичність для
мікроорганізмів
Неякісний посуд (залишки миючих засобів),
неочищена вода, підпалювання середовища.
32
Контамінація
мікроорганізмами
Невірна/недостатня
стерилізація
готового
середовища,
недотримання
асептичних
умов
додавання окремих (стерильних) компонентів
середовища, або під час розливання та фасування
готового середовища.
Зберігання
готових
поживних
середовищ.
Найкраще
використовувати свіжовиготовлені середовища. Проте, за необхідністю
більш тривалого збереження, середовища у пляшках можуть зберігатися
у захищеному від світла та прохолодному (12-16°С) місті до 6 місяців.
Строк збереження готових поживних середовищ залежить від їх складу.
Середовища заборонено заморожувати!
Під час приготування поживних середовищ можуть виникнути певні
помилки (таб.1).
ЗАВДАННЯ:
1. Розглянути види субстратів та вимоги до сировинної бази.
2. Опанувати метод приготування рідкого середовища МПБ згідно
рекомендацій виробника.
3. Опанувати метод приготування твердого середовища МПА, згідно
рекомендацій виробника.
4. Опанувати метод рН-метрії поживних середовищ.
5. Опанувати методи стерилізації шляхом автоклавування та фільтрації.
Лабораторна робота №6
МЕТОДИ
СТЕРИЛІЗАЦІЇ
В
БІОТЕХНОЛОГІЇ
ОТРИМАННЯ ІМУНОБІОЛОГІЧНИХ ПРЕПАРАТІВ
Мета: оволодіти різними методами стерилізації, зокрема, поживних
середовищ.
33
Важливим
елементом
у
процесі
виготовлення
кінцевого
імунобіологічного препарату є стерилізація – знищення усіх форм життя
(зокрема, живих мікроорганізмів) у стані вегетації та спокою.
Стерилізації обов‘язково піддають усі матеріали, захисний одяг,
інструменти, посуд, поживні середовища, пакувальні матеріали, що
використовуються у процесі виготовлення стерильних імунобіологічних
препаратів. Усі потоки можуть стерилізуватися термічним, радіаційним,
хімічним, фільтраційним та комбінованими методами. Дія усіх
стерилізуючих агентів базується на інактивації внутрішньоклітинних
речовин, необхідних для росту та репродукції клітин.
Стерилізація радіацією. Радіаційна стерилізація використовується,
головним чином, для стерилізації матеріалів і продукції, що чутливі до
нагрівання. Багато лікарських засобів і деякі пакувальні матеріали чутливі
до радіації, отже цей метод припустимий лише у випадку відсутності
шкідливого впливу на продукцію. Тому цей метод використовують для
стерилізації невеликих об’єктів (хірургічний інструмент, перев’язочний
матеріал). Під час процесу стерилізації слід вимірювати дозу
випромінювання. Для цих цілей слід використовувати дозиметри,
показання яких не залежать від інтенсивності випромінювання, але
забезпечують кількісну реєстрацію дози випромінювання, поглиненою
стерилізованою продукцією.
Хімічний метод стерилізації базується на використанні речовин, які
володіють дезінфікуючими властивостями. Основна проблема цього
методу полягає у видаленні стерилізуючого агенту з поживного
середовища. Це досягається шляхом розкладення агентів з утворенням
нетоксичних для виробничої культури продуктів.
Термічний метод. Найбільш часто у технологічному процесі
виготовлення стерильних імунобіологічних препаратів використовують
термічний метод стерилізації. Він базується на згубному впливі на живі
клітини високих температур. Стерилізація досягається фламбуванням
(обробкою відкритим полум‘ям), сухим гарячим повітрям, кип‘ятінням та
насиченою парою. Для стерилізації посуду, матеріалів, одягу,
34
інструментів, поживних середовищ та розчинів найкраще зарекомендував
себе метод обробки парою під тиском за допомогою автоклавів.
Конструктивно
автоклави
бувають
декількох
видів:
що
обертаються, гойдаються, горизонтальні, вертикальні та у вигляді
колони.
Автоклав-стерилізатор
оснащується
механічними,
електромагнітними або пневматичними змішувачами, контрольно-
вимірювальними приладами для вимірювання та регулювання тиску,
температури та інших показників. У порівнянні з стерилізацією сухим
повітрям автоклавування більш ефективно у зв‘язку з тим, що
теплоємність водяної пари у 3600 разів більша ніж теплоємність сухого
повітря за однакової температури. Проте, обов‘язковою умовою
ефективної стерилізації є одночасне поєднання температури, тиску, часу та
водяної пари. Основою будь якого стерилізатора є герметична камера, у
якій відбувається процес стерилізації та парогенератор. У простих
автоклавах
елементи
нагрівання
розміщенні
безпосередньо
у
стерилізуючій камері, що частково заповнена водою для створення пари.
Дія цих автоклавів побудована за принципом скороварки. Пара, що
утворюється під час кипіння води, витискає повітря через клапан, що
розташований у верхній частині камери. Для уникнення корозії від хлору
звичайної водопровідної води для роботи автоклаву необхідно
використовувати дистильовану воду.
Згідно європейського стандарту prEN 13060/1-4 автоклави
поділяються на три класи:
Автоклави класу «В» - мають функцію попередньої вакуумізації та
функцію вакуумного висушування, можуть стерилізувати будь-які форми
медичних виробів та тканин: великі, порожнисті, запаковані у пакувальні
матеріали будь якого типу (інструменти, білизна, одяг, посуд).
Автоклави класу «S" – призначені для стерилізації гладеньких або
порожнинних інструментів в упакуванні або без упакування.
Автоклави класу "N" – призначені для стерилізації металевих
інструментів безпосередньо у лотку та не запакованих тканинних
матеріалів без порожнин та щілин.
Найчастіше стерилізуються автоклавуванням поживні середовища
35
Співвідношення температури та тиску у автоклаві представлені у
таблиці 2.
Таблиця 2.
Тиск насиченої пари у автоклаві, кПа
Температура, ° С
34,47
108
68,95
116
103,42
121
137,90
127
172,37
131
206,84
134
1 атм.=101,325 кПа
СТЕРИЛІЗАЦІЯ РОЗЧИНІВ ТА СЕРЕДОВИЩ. Вибір методу
стерилізації середовищ залежить від складу останніх. Деякі складники
середовищ допускається використовувати без стерилізації (наприклад,
етиловий спирт), а деякі середовища не потребують стерилізації
автоклавуванням, їх можна використовувати зразу після кип‗ятіння
(наприклад, середовище для вирощування представників родини
Enterobacteriaceae, що містить бріліантовий зелений, особливо чутливе до
нагрівання, тому після приготування, його швидко охолоджують та
захищають від яскравого світла).
Проте, більшість середовищ потребує стерилізації. Стерилізація
поживних середовищ парою використовується у двох режимах:
cтатичному в умовах автоклаву та стерилізація з перемішуванням.
Режими стерилізації поживних середовищ залежать від складу
останніх (таб.3). Час нагріву стерилізаційної камери автоклаву (від 20 до
121
о
С) залежить від конструкції останнього та контролюється
манометром.
Час досягнення необхідної температури у масі поживного середовища
залежить від об‘єму контейнеру та щільності завантаження автоклаву. Цей
час контролюється термопарою та складає для ємностей 100 см
3
– 12 хв,
500 см
3
– 18 хв, 1000 см
3
– 22 хв. Середовище нагрівається до тих пір поки
Т
о
С середовища в середині ємності стане рівною Т
о
С пари. З цього
моменту починається процес стерилізації. Щільність завантаження
автоклаву напряму впливає на час нагрівання середовища до температури