ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 03.11.2019
Просмотров: 3820
Скачиваний: 1
9. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериологические методы
исследования
- это совокупность методов
изучения свойств микроорганизмов, определения их систематического
положения. Для этого необходимо прежде всего изолировать отдельные виды
микробов и вырастить их в виде так называемых «чистых культур», а затем
идентифицировать, т.е. установить соответствие выделенных микроорганизмов
видам, описанным в специальных определителях.
Колония
- это популяция микробных клеток одного вида, сформировавшаяся в
результате деления одной микробной клетки в условиях культивирования на
плотной
питательной
среде
при
оптимальной
температуре.
Чистая культура -
масса клеток, состоящая из микроорганизмов,
принадлежащих одному виду и полученных как потомство одной клетки. Чистую
культуру обычно получают путем пересева на стерильную питательную среду
клеток,
взятых
из
отдельно
стоящей
колонии
бактерий.
Культуральные свойства
бактерий устанавливаются по морфологии колоний и
особенности
роста
культуры
на
питательных
средах.
Биохимические признаки (свойства)
бактерий определяются набором
ферментов,
присущих
определенному
роду,
виду,
варианту.
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ
Питательные среды предназначены для накопления, выделения, изучения и
сохранения
микроорганизмов.
По составу питательные среды могут быть
синтетическими
и
натуральными
.
По консистенции
питательные среды могут быть
жидкими
,
полужидкими
(0,2-
0,7%
агара)
и
плотными
(1,5-2%
агара).
Различают
питательные
среды
общего
назначения
(
универсальные
)
и
специальные
питательные
среды.
Питательные
среды
общего
назначения
пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и
применения в качестве основы для приготовления специальных питательных
сред.
Специальные питательные среды
предназначены для избирательного
культивирования определенных видов микроорганизмов, изучения их свойств и
хранения.
МЕТОДЫ ПОСЕВОВ
В зависимости от цели исследования, характера посевного материала и среды
используют различные методы посева. Все они включают обязательную цель:
оградить посев от посторонних микробов, поэтому посев производят в
асептических
условиях.
Для посевов на плотные питательные среды применяют шпатель,
бактериологическую петлю, иглу, тампон. При посеве проводят петлей по
поверхности среды линии, оставляя при этом клетки бактерий на среде. После
посева чашки закрывают и переворачивают их вверх дном. Надписи на чашках
делают со стороны дна, а на пробирках - в верхней части.
При посеве на жидкую среду петлю слегка погружают в жидкость и растирают
посевной материал на стенке пробирки, после чего смывают его средой.
МЕТОДЫКУЛЬТИВИРОВАНИЯ
И ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ БАКТЕРИЙ
Для успешного культивирования, помимо правильно подобранных сред и
правильно произведенного посева, необходимы оптимальные условия:
температура, влажность, аэрация (снабжение воздухом). Культивирование
анаэробов сложнее, чем аэробов, для удаления воздуха из питательной среды
используют
различные
способы.
Выделение отдельных видов бактерий (
чистой культуры
) из исследуемого
материала, содержащего, как правило, смесь различных микроорганизмов,
является одним из этапов любого бактериологического исследования. Чистой
культурой микробов
получают из изолированной микробной колонии.
При выделении чистой культуры из крови (
гемокультуры
)
ее предварительно
«подращивают» в жидкой среде: 10-15 мл стерильно взятой крови засевают в 100-
150 мл жидкой среды. Соотношение засеваемой крови и питательной
среды
1:10
не случайно - так достигается разведение крови (неразведенная кровь
губительно действует на микроорганизмы).
Этапы
выделения
чистой
культуры
бактерий
I
этап
(нативный
материал)
Микроскопия
(ориентировочное
представление
о
микрофлоре).
Посев
на
плотные
питательные
среды
(получение
колоний).
II
этап
(изолированные
колонии)
Изучение
колоний
(культуральные
свойства
бактерий).
Микроскопическое
изучение
микробов
в
окрашенном
мазке
(морфологические
свойства
бактерий).
Посев на скошенный питательный агар для выделения чистой культуры.
III
этап
(чистая
культура)
Определение
культуральных,
морфологических,
биохимических
и других свойств для идентификации культуры бактерий
ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ
Идентификацию выделенных бактериальных культур проводят путем изучения
морфологии бактерий, их культуральных, биохимических и других признаков,
присущих каждому виду.
10. лигандные методы радиоактивные флуорисцентные, люминисцентные
ферментные метки
Метод меченых атомов применяется при изучении биохимических процессов,
происходящих в живых клетках. Чтобы проследить за превращениями какого-
либо вещества, в него вводят радиоактивную метку, т. е. заменяют в его молекуле
один из атомов соответствующим радиоактивным изотопом (3Н,32Р,14С). Как
известно, по химическим свойствам изотопы одного и того же элемента не
отличаются друг от друга, но зато радиоактивный изотоп сигнализирует о своем
местонахождении радиоактивным излучением. Это позволяет проследить за
определенным химическим веществом, установить последовательность этапов его
химических превращений, продолжительность их во времени, зависимость от
условий и т. д.
Люминесцентная диагностика в основе которого лежит свечение пораженных
дерматофитией волос в спектре ультрафиолетовых лучей с определенной длиной
волны. Лампа Вуда, несмотря на широкое применение и простоту в
использовании, не дает возможность поставить точный диагноз, а является лишь
одним из вспомогательных видов исследований.
Флуоресцентные метки
служат для того, чтобы идентифицировать наличие или
пространственное положение исследуемой молекулы. Флуоресцентная метка
должна быть химически стабильной и демонстрировать стабильную
флуоресценцию, которая не зависит от внешних факторов и минимально меняется
во времени. Таким образом, она действует как пассивный «маяк», который
сигнализирует о месте нахождения молекулы, к которой привязана.
Флуоресцентный зонд
является более сложным по своим функциям. Это
молекулярная конструкция, которая может существовать в двух состояниях:
«выключенном» и «включённом». Эти состояния различаются между собой
определёнными параметрами флуоресцентной эмиссии (чаще всего квантовым
выходом флуоресценции, позицией максимума в спектре эмиссии или
возбуждённого состояния). Переход между «включён» и «выключен»
состояниями зависит от наличия в среде зонда тех молекул, которые он должен
распознавать.
Иммунный анализ основывается на взаимодействии антигена (АГ) и антитела
(АТ) с использованием различных вариантов мечения одного из компонентов
(фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель и другие). Оценка реакции
проводится автоматически на специальной аппаратуре, что позволяет
стандартизировать эти методы.
В зависимости от типа используемой метки и условий постановки теста
иммунный анализ обозначается как иммуноферментный (ИФА), радиоиммунный
(РИА), иммунофлуоресцентный и другие. При постановке реакций в один или
несколько этапов они обозначаются как прямые или непрямые. Имеет значение
среда, в которой проводится реакция. Если реакция проводится с реагентами,
фиксированными на поверхности, то тест обозначается как твердофазный,
например ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).
11. Размещение, оборудование, правила организации, безопасность работы
бактериологической лаборатории в учреждении здравоохранения. Задачи,
решаемые бактериологической лабораторией.
состав микробиологической лаборатории:1) лабораторные комнаты для
проведения микробиологических исследований; 2) моечная;3) препараторская для
подготовки лабораторной посуды, приготовления питательных сред и других
вспомогательных работ; 4) автоклавная; 5) помещение, где производят прием
материала и выдачу результатов исследования. Лабораторных животных,
содержат в (виварии). В лабораториях, где объем работ невелик, можно
объединить моечную и препараторскую, исключить комнату для приема анализов
и т. д. Лабораторные комнаты должны быть просторными и светлыми, желательно
с ориентацией окон на север или северо-запад, так как для работы необходим
рассеянный свет. Стены окрашивают светлой масляной краской, пол покрывают
линолеумом, лабораторные столы – пластиком или стеклом. В лабораторной
комнате оборудуют застекленный бокс с предбоксником для проведения работ в
стерильных условиях. В лабораторных помещениях располагают специальное
оборудование: термостат, холодильник, шкафы, центрифугу и др. строго
соблюдать следующие правила: 1. Находиться в лаборатории можно только в
халате и шапочке.2. В лабораторию нельзя вносить посторонние вещи,
хранить там продукты, принимать пищу. 3. Весь исследуемый материал,
поступающий в лабораторию, считается заразным; во время работы необходимо
соблюдать осторожность, следить за чистотой рук.4. Исследуемый биологический
материал и отработанные культуры подлежат уничтожению. 5. По окончании
работы руки,лабораторный инструментарий, а также рабочее место обрабатывают
дезинфицирующим раствором. Культуры микробов, необходимые для
дальнейшей работы, ставят в холодильник. Уборку лабораторных помещений
проводят ежедневно с применением дезинфицирующих средств. Посуду
обеззараживают в автоклаве. В пипеткивводят кусок проволоки, на конец которой
плотно накручивают кусок ваты, и тщательно их протирают. Предметные и
покровные стекла должны быть хорошо обезжирены. Вымытую лабораторную
посуду ставят в сушильный шкаф или сушат на воздухе, пробирки закрывают
пробками из ваты, заворачивают в бумагу и стерилизуют в сушильном шкафу.
Режим работы микробиологической лаборатории зависит от степени опасности
работы с тем или иным возбудителем. I – возбудители чумы; II – возбудители
высококонтагиозных эпидемических заболеваний: бруцеллеза, туляремии,
сибирской язвы, сапа, натуральной оспы, различных риккетсиозов и др.; III –
возбудители эпидемических бактериальных инфекций: кишечных, туберкулеза,
дифтерии, патогенные анаэробы, спирохеты (возвратный тиф), простейшие
(малярия) и др.; IV – все патогенные кокки, гемоглобинофильные бактерии,
сальмонеллы. Работа с культурами I и II групп инфекций проводится только в
специальных лабораториях, III группы – в лабораториях СЭС, IV группы – во всех
бактериологических
лабораториях.
В
бактериологической лаборатории
существуют специальные формы регистрации и учета исследуемого материала,
выделенных культур, их уничтожения, передачи культур патогенных микробов
внутри лаборатории и вне ее.
12. Виды клинического материала. Определение вида и объема клинического
материала, необходимого для исследования. Сроки взятия материала.
Способы взятия материала. Условия и способы транспортировки и хранения
материала. Транспортные питательные среды.
В зависимости от характера патологического процесса, места максимальной
(избирательной) локализации
возбудителя и пути его выделения в окружающую
среду могут
исследовать следующий биологический материал:− мокроту (при
заболеваниях органов дыхания);− испражнения (при желудочно-кишечных
инфекциях);− мочу (при поражении почек и мочевыводящих путей);− гнойное
отделяемое (из гнойных очагов);− кровь (при кровяных инфекциях).
Испражнения
собирают в стерильные картонные тарелки или судно, предварительно
обработанное раствором хлорной извести и тщательно промытое горячей водой
для уничтожения следов дезинфицирующего раствора. Испражнения берут
стерильным шпателем и вносят в стерильную пробирку с пробкой, содержащую
консервант (глицериновая смесь, фосфатно-буферная смесь и др.). Можно брать
биологический материал специальной стеклянной ректальной трубкой, которую
вводят в прямую кишку на 8–15 см. Мочу забирают стерильным катетером в
пробирку или банку.Рвотные массы собирают в стерильную широкогорлую банку,
которую закрывают вощеной бумагой, мокроту – в стерильную банку с пробкой
или в стерильную чашку Петри. Гнойное отделяемое ран, мазки из зева и носа
берут стерильным ватным тампоном на проволоке. Кровь из вены для посева
берут стерильным шприцем, предварительно обработав локтевой сгиб 75%
спиртом,и у постели пациента засевают в количестве 5–10 мл во флакон с жидкой
питательной средой в соотношении 1:10 (10 мл крови в100 мл питательной среды).
Трупный материал для микробиологического исследования необходимо брать в
первые часы после смерти, так как в дальнейшем микрофлора кишечника
распространяется по всему организму. Кровь из сердца берут стерильным
шприцем. Из селезенки, печени и других органов после предварительного
прижигания их поверхности вырезают стерильными ножницами кусочек и
помещают в стерильный сосуд. При взятии участка кишечника или желудка
предварительно накладывают две лигатуры выше и ниже места взятия. Материал,
содержащий вирусы, должен и при транспортировке находиться в условиях
низкой температуры (например в термосе со льдом). Доставку инфицированного
материала в лабораториюследует производить в закрытой посуде, в специальных
металлических биксах, пеналах, чемоданах. Доставка особо опасного материала
(от пациентов с холерой, чумой, натуральной оспой и др.) осуществляется в
соответствии со специальными инструкциями. Исследуемый материал помещают
в плотно закрывающиеся сосуды, обвязывают пергаментом или другим
водонепроницаемым материалом, после чего их обертывают салфетками,
смоченными 5% раствором фенола или лизола. После этого сосуды помещают в
жестяные коробки с крышкой или металлические биксы. Поступивший в
лабораторию биологический материал регистрируют в специальном журнале.
Исследуемый материал в лаборатории можно хранить: неконсервированный – при
температуре 4°С не более 1–2 суток, консервированный в 50% глицерине,
например кусочки органов и тканей, в течение недель. транспортные среды.
состоит из стерильных полипропиленовых пробирок содержащей разную
транспортную среду, стерильного ватного, вискозного тампона с пробкой.
Отбор проб сохраняются в пределах 48-72 часов. -
STUART
при выделении
Neisseriaspp. Эта среда не содержит питательных веществ, предотвращает
пролиферацию микроорганизмов. -
AMIES
для сбора и транспортировки, а
также и хранения практически всех видов микроорганизмов. нейтрализующим
токсичные для микроорганизмов метаболиты. -
CARY-BLAIR
для сбора и
транспортировки, а также хранения образцов, возбудителями кишечных
инфекций.