ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 03.11.2019
Просмотров: 3823
Скачиваний: 1
поверхности Е-теста. Величину МПК учитывают в том месте,
где граница зоны подавления роста вплотную подходит к
носителю. Детальные инструкции по определению
чувствительности с использованием Е-тестов прилагаются
изготовителем к набору реактивов.
17. Диско-диффузионный метод определения чувствительности бактерий к
антибактериальным препаратам. Понятие о класс-дисках. Контроль дисков.
Контрольные типовые штаммы. Контроль качества исследования
.Данный
метод основан на способности АБП диффундировать из пропитанных ими
бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост микроорганизмов,
посеянных на поверхности агара. При определении чувствительности ДДМ
толщина слоя агара в чашке 4,0±0,5 мм Для определения чувствительности ДДМ
следует использовать только стандартизированные качественные диски. Для
инокуляции приготовленных чашек с агаром используют два способа:
1. Наиболее удобным способом инокуляции является
использование стерильных ватных тампонов. Тампон
погружают в стандартную суспензию микроорганизма, затем
избыток инокулюма удаляют, отжав тампон о стенки пробирки.
Инокуляцию проводят штриховыми движениями в трех
направлениях, поворачивая чашку Петри на 60°.
2. При использовании второго способа стандартный
инокулюм наносят пипеткой на поверхность чашки Петри с
питательной средой в объеме 1–2 мл, равномерно распределяют
по поверхности покачиванием, после чего удаляют избыток
инокулюма пипеткой.
Не позднее 15 мин. после инокуляции на поверхность
питательной среды наносят диски с АБП. Их аппликацию
проводят с помощью стерильного пинцета или автоматического
диспенсера. Расстояние от диска до края чашки и между
дисками должно составлять 15–20 мм. Таким образом, на одну
чашку диаметром 100 мм помещается не более 6 дисков с АБП.
Диски должны равномерно контактировать с поверхностью
агара, для чего их прижимают пинцетом. После аппликации
дисков чашки Петри помещают в термостат вверх дном и
инкубируют при температуре 35°С в течение 18–24 ч (в
зависимости от вида тестируемого микроорганизма).
После окончания инкубации чашки помещают вверх дном
на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них
под углом в 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон
задержки роста измеряют с точностью до 1 мм,
предпочтительнее пользоваться штангенциркулем или
кронциркулем (рис. 3).
При измерении зон задержки роста следует
ориентироваться на зону полного подавления видимого роста.
Не следует обращать внимания на очень мелкие колонии,
выявляемые в пределах зоны задержки роста только при особых
условиях освещения или при увеличении. Крупные колонии,
выявляемые в пределах четкой зоны подавления роста,
свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры или о
гетерорезистентности популяции микроорганизмов, в этом
случае необходимо повторить идентификацию микроорганизма,
формирующего эту колонию, и определение чувствительности
данного штамма.
18. ускоренные методы определения чувствительности. Метод прямого
посева
Автоматический посев:
1. С помощью прецизионных шприцев прибор отбирает точное количество
подготовленного материала через стилус – тонкий капилляр из мягкого пластика.
2. Стилус опускается на поверхность агара в центр чашки Петри, укрепленной на
вращающемся столике.
3. При касании агара из стилуса равномерно и точно начинает поступать посевной
материал. В зависимости от моделей приборов посев может быть равномерным
(сплошным или гомогенным)
(1)
, спиральным (экспоненциальным)
(2
),
концентрическим (круговым)
(3)
или глубинным (в толщу агара)
(4)
, что показано
на рисунке.
4. После посева стилус промывается антисептическим раствором, далее
многократно промывается стерильной дистиллированной водой. После этого он
готов к посеву нового образца.
С использованием метода нанесения образца
Spiral®
в логарифмической
последовательности уменьшается объем образца, распределяемого по чашке
Петри в виде Архимедовой спирали от центра к краю. При этом можно
откалибровать объем нанесенного образца в каждой точке площади посева.
Концентрация микроорганизмов определяется по количеству колоний,
обнаруженных в единице объема нанесенного образца в каждом секторе чашки.
Особенности приборов для автоматических посевов в микробиологических
исследованиях:
Максимальная стандартизация процедуры микробиологического посева
Возможность установки в ламинарный шкаф
Уникальная система дезинфекции, которая обеспечивает стерилизацию
устройства с отсутствием риска перекресобразцов
Высокая точность объемов нанесения образцов - 0,5%
Выбор одного из 4-х методов посева на чашки, диаметром 55, 90 или 150 мм
Высокая скорость разведения образца и его посева (один полный цикл,
включающий в себя обеззараживание, си посев занимает около двух минут)
Ускоренные методы определения чувствительности микроорганизмов к
антибиотикам
В
практике
лабораторий
ускоренное
определение
чувствительности
микроорганизмов к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам
осуществляется некоторыми зарубежными автоматизированными системами
микробиологических исследований (MS-2, Qantum 2, Sceptor и др.). В кюветах
панели содержатся дегидрированные субстраты или диски с антибиотиками.
Каждый антибиотик в кювете представлен в одной концентрации,
соответствующей
критерию
принадлежности
бактерий
к
группе
"чувствительных" к антибиотику. Одновременно тестируется 20 и более
антибиотиков. После внесения взвеси испытуемых бактерий посевы инкубируют
при 35-37°С в течение 4-5 ч. Результаты регистрируют спектрофотометрически
или кондуктометрически сразу при появлении размножения бактерий в контроле
без антибиотика.
Для ускоренного определения чувствительности или устойчивости бактерий к
бета-лактамным антибиотикам широко используются различные методы
выявления бета-лактамазной активности бактерий. Представляем один из методов
определения бета-лактамазы бактерий (Сиволодский Е.П., 1980). На
фильтровальную бумагу (2х2 см) в чашке Петри наносят одну каплю 2% раствора
водорастворимого крахмала. После ее впитывания наносят петлей в центр бумаги
агаровую культуру испытуемых бактерий (например, стафилококков) и растирают
в виде бляшки диаметром 3-4 мм. На поверхность бляшки наносят одну каплю
(0,05 мл) рабочего йодного раствора бензил-пенициллина. После экспозиции 10
мин при комнатной температуре учитывают результаты реакции. Наличие бета-
лактамазы: на темно-синем фоне четкая зона полного просветления вокруг бляшек
бактерий. Отсутствие бета-лактамазы: на темно-синем фоне нет зоны
просветления вокруг бляшки, края бляшки нечеткие, сливаются с фоном. Наличие
бета-лактамазы указывает на устойчивость бактерий к антибиотику.
Реактивы на бета-лактамазу: реактив №1 - 0,005-молярный раствор йода (йод -1,27
мг/мл, калия йодид -15 мг/мл; 1/15 -молярный фосфатный буфер рН 6,5 до
необходимого объема); реактив №2 - 2% раствор водорастворимого крахмала;
реактив №3 - рабочий йодный раствор бензилпенициллина (во флакон,
содержащий 500 000 ED бензилпенициллина, вносят 10 мл реактива № 1), годен в
течение 2 ч.
19. нормальная микрофлора.
Под нормальной микрофлорой понимают совокупность всех сложных
эволюционно-закрепленных микробиоценозов органов и тканей или участков
тела, контактирующих с внешней средой (индигенная флора, аутофлора,
аутохтонная, эубиоз, резидентная микрофлора).
Нормофлора включает в себя свыше 500 видов микроорганизмов с общим числом
более 1014 клеток. На состав микрофлоры влияют:
тип дыхания,
наличие питательного субстрата,
физико-химические условия среды,
наличие бактерицидных факторов,
микробный антагонизм,
развитость и состояние иммунной защиты.
Большое значение в изучении нормальной микрофлоры играет гнотобиология -
наука, которая изучает жизнь макроорганизма не примере специально
выращенных безмикробных животных.
. Выдены следующие функции нормальной микрофлоры:
- блокирование рецепторов адгезии;
- антагонистическая, за счет продукции короткоцепочечных жирных кислот,
перекисей, бактериоцинов и других антимикробных субстанций;
- витаминообразующая;
- участие в пищеварении;
- участие в минеральном обмене (Ca, Na, K, Fe, Mg и др.);
- детоксикация ксенобиотиков за счет их адсорбции или биотрансформации;
- индукция иммунного ответа, продукция стимуляторов и активаторов
фагоцитарной и ферментативной активности;
- стимуляция обновления эпителия на поверхности ворсинок и др.;
- противоопухолевая;
- регуляция всасывания и др.
Микробный состав отдельных биотопов требует отдельного рассмотрения.
Механизм формирования нормальной микрофлоры.
Нормальная микрофлора формируется в процессе жизни человека при активном
участии самого макроорганизма и различных сочленов биоценоза. Первичное
заселение микробами организма, стерильного до рождения, происходит в
процессе родов, а затем микрофлора формируется под влиянием окружающей
ребенка внешней среды и прежде всего при контакте с ухаживающими за ним
людьми. Огромную роль в становлении микрофлоры играет питание.