ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 01.12.2019
Просмотров: 3460
Скачиваний: 3
рис. 21). Недавно [Seo et al., 2001] был обнаружен еще один авто каталитический цикл, заключающийся в индукции ме-тилжасмонатом экспрессии гена метилтрансферазы (S-аде-нозил-метионин: жасмоновая кислота - карбоксил-метил-трансферазы), катализирующей реакцию метилирования жасмоновой кислоты.
Можно предположить, что промежуточные и конечные продукты липоксигеназного метаболизма активируют проте-инкиназы и, таким образом, осуществляют умножение сигнала и его передачу на геном растительных клеток. К сожалению, сведений об этом в литературе очень мало. Известно, что активировать мембраносвязанные протеинкиназы растений способны оба типа продуктов реакции, катализируемой фосфолипазами А2, - как лизофосфолипиды (особенно, лизо-фосфатидилхолин и лизофосфатидная кислота), так и ненасыщенные жирные кислоты [Scherer, 1996 a, b; Klucis, Polya, 1987; Lucantoni, Polya, 1987]. При этом лизофосфатидилглице-рол, лизофосфатидилсерин и лизофосфатидилэтаноламин не оказывают активирующего действия на протеинкиназы.
Несмотря на то что конкретные молекулярные механизмы активации генов различными оксилипинами еще недостаточно изучены, можно утверждать, что они обладают способностью вызывать экспрессию генов, кодирующих белки, принимающие участие в повышении устойчивости растений к абиогенным стрессорам и в защитных реакциях против патогенов. Так, экзогенный жасмонат приводит к синтезу целого набора так называемых жасмонатиндуциру-емых белков [Mueller-Uri et al., 1988; Herrmann et al., 1989; Sembdner, Parthier 1993]. Среди них имеются ингибиторы протеиназ 1 и 2, ингибитор трипсина, тионин, напин, круци-ферин, вегетативные запасные белки, фенилаланин-аммо-ний-лиаза, халконсинтаза, липоксигеназа, полифенолокси-даза и др. Имеются данные [Farmer, Ryan, 1992], что не только жасмонат, но и его метаболические предшественники -13(8)-гидроперокси-9(г),(Е),15(Х)-октадекатриеновая кислота и 12-оксо-10,15(г)-фитодиеновая кислота - инициируют образование стрессовых белков, в частности ингибиторов протеиназ. Высказывается мнение [Parchmann et al., 1997], что 12-оксофитодиеновая кислота, проявляющая даже большую активность в индукции защитных белков, чем жасмонат, является главным индуктором экспрессии генов
при местной реакции клеток на стрессоры, а за счет жасмо-ната и метилжасмоната обеспечивается передача сигнала в удаленные от места воздействия стрессора ткани и органы и формирование в них системного иммунитета. Это мнение подтверждается тем, что в отличие от жасмоната 12-оксофитодиеновая кислота не секретируется из культуры растительных клеток в среду.
Обнаружено также, что летучие продукты липоксигеназного метаболизма могут индуцировать (в том числе в соседних растениях) защитную реакцию. Так, т/?анс-2-гексеналь вызывал образование фенилаланин-аммоний-лиазы, катали-шрующей образование предшественников растительных антибиотиков - фенилпропаноидных фитоалексинов. Показано [Fukuda et al., 1997], что 4-гидрокси-2-ноненаль индуцировал синтез глутатион-Б-трансферазы, участвующей в обезвреживании токсичных для растений веществ.
Одно из свойств сигнальных систем - возможность торможения (прерывания) прохождения сигнала после того, как он был воспринят клеткой. Такая возможность была продемонстрирована и в отношении липоксигеназной сигнальной системы. Установлено [Avdiushko et al., 1995], что метилжасмонат активирует 13-гидропероксидлиазу; это приводит не только к усилению продукции бактерицидных и фунгицидных гексеналей, но соответственно к уменьшению доли метаболического потока, направляемого в сторону жасмоната и метилжасмоната (эффект автоингибирова-н ия своего синтеза, проявляющийся, по-видимому, при достижении пороговых концентраций метилжасмоната). Оказалось, что дивиниловые эфиры - колнелевая и этеролевая кислоты - могут ингибировать активность липоксигеназ и таким образом затруднять функционирование липоксиге-пазной сигнальной системы [Corey et al., 1987]. Колнелевая кислота является активным ингибитором 9-липоксигеназы, j-геролевая кислота - 13-липоксигеназы [Гречкин, неопубликованные данные]. Предполагается, что ингибирующее действие на липоксигеназную активность может также оказывать эпоксидный продукт превращения 9-гидроперокси-линолената [Sok, Kim, 1989].
Итак, результаты изучения сигнальных функций липоксигеназного метаболизма позволяют считать, что ему присущи основные свойства, характерные и для других сиг-
нальных систем, - рецепция, преобразование и умножение сигнала, приводящие (при участии протеинкиназ) к экспрессии определенных генов и соответствующему ответу растительной клетки.
В связи с тем что участие протеинкиназ является важнейшим звеном сигнальных систем клеток растений, особую значимость приобретают данные о влиянии интермеди-атов липоксигеназного метаболизма на фосфорилирование белков растений [Каримова и др., 19996]. Показано, что экзогенная 12-гидроксидодеценовая кислота (ГДК) в небольших концентрациях является очень активным стимулятором роста, более активным, чем травматин и жасмоновая кислота [Гречкин, 1992]. Поскольку нельзя было исключить возможность участия ГДК в функционировании сигнальных систем, мы поставили перед собой задачу исследовать ее влияние на фосфорилирование белков, имея в виду, что протеинкиназные реакции являются важнейшим звеном всех известных сигнальных систем клеток.
ГДК в широком диапазоне концентраций (с максимумом при 10"7 М) вызывала значительное повышение содержания радиоактивного фосфата во фракции растворимых белков. Поскольку при гомогенизации листьев и в реакционной смеси использовались неспецифические ингибиторы фосфатаз, эффект отщепления фосфата от белков в процессе обработки материала был минимальным. ГДК оказывала больший стимулирующий эффект на фосфорилирование белков, чем такой известный эффектор протеинкиназ-ной активности, как цАМФ. Метилжасмонат также вызывал большее фосфорилирование белков, чем цАМФ, но меньшее, чем ГДК.
Результаты экспериментов по разделению фосфорили-рованных белков и определению их радиоактивности показали, что обработка ГДК приводила к значительному повышению уровня фосфорилированности трех полипептидов низкой молекулярной массы (10-24 кДа) и высокомолекулярного полипептида 70 кДа (рис. 22). Из данных рисунка следует, что уровень радиоактивности отдельных полипептидов (в области 40 кДа) был ниже в варианте с обработкой растений ГДК.
Фосфорилирование белков участвует в регуляции множества процессов [Protein Phosphorylation in Plants, 1996].
Молекулярная масса белков, кДа
Рис. 22. Влияние 12-гидроксидодеценовой кислоты (ГДК) на фос-форилирование белков [Каримова и др., 19996] гомогената трехдневных растений гороха
1 - контроль; 2 - ГДК (0,1 мкМ). Рентгенограммы сканировали на денситографе ИФО-450. Стрелками указаны молекулярные массы белков, радиоактивность которых подвергалась наибольшим изменениям
Получены данные о существовании в растениях различных типов протеинкиназ и об участии фосфорилирования белков в экспрессии защитных генов после взаимодействия различных патогенов, элиситоров и стрессовых гормонов с клетками растений [Grab et al., 1985; Dietrich et al., 1990; Farmer et al., 1991; Bolwell et al., 1996]. О важной роли фосфорилирования белков в формировании устойчивости растений к патогенам свидетельствуют данные о том, что некоторые клонированные гены, кодирующие защитные белки растений, повышающие их устойчивость к инфицирова-
нию патогенами, имели большое сходство с генами, кодирующими протеинкиназу [Martin et al., 1993]. Если роль в целом липоксигеназной системы в формировании защитного ответа растений достаточно известна, то данные о значительном усилении фосфорилирования белков под влиянием промежуточного продукта липоксигеназного метаболизма (самой быстрой его ветви) получены [Каримова и др., 19996] впервые.
Тот факт, что под влиянием ГДК уровень фосфорилированности различных полипептидов изменился в разной степени (см. рис. 22), свидетельствует в пользу того, что она может неодинаково влиять на активность ферментов (про-теинкиназ и протеинфосфатаз), определяющих баланс скоростей фосфорилирования и дефосфорилирования отдельных полипептидов.
Повышение уровня общего фосфорилирования белков под влиянием цАМФ не вызывает удивления, так как известно существование цАМФ-активируемых протеинки-наз. Большее фосфорилирование белков под влиянием ме-тилжасмоната тоже объяснимо, так как известно, что жас-монат и метилжасмонат могут включать (пусть не полностью) ответную реакцию растений, характерную для механического повреждения тканей или инфицирования патогенами. Известно, что в этих случаях активируются сигнальные системы клеток, в том числе не только циклоаде-нилатная. Наибольшее фосфорилирование белков под влиянием ГДК свидетельствует или о существовании активируемых непосредственно ГДК протеинкиназ, или о включении с помощью экзогенной ГДК совокупности сигнальных систем клеток, причем не только циклоаденилатной (поскольку цАМФ вызывал меньший эффект), но и кальциевой, и НАДФ-оксидазной [Chandra, Low, 1995], и, возможно, "собственной" липоксигеназной системы. Факты такого влияния продуктов фосфолипазных и липоксиге-назных реакций обнаружены у животных [Гамалей, Клю-бин, 1996] и растительных [Гречкин, Тарчевский, 1999] клеток.
Выявлено [Гречкин и др., 1987], что ГДК является преобладающим продуктом метаболизации гидроперекисей линолевой и линоленовой кислот у бобовых. Высокая рост-стимулирующая активность 12-ГДК обнаружена в опытах
Рис. 23. Схема радиоавтографов электрофореграмм белков, характеризующая влияние инфицирования микоплазмами и обработки жасмоновой кислотой на синтез полипептидов [Тарчевский и др., 19966]
1 - контроль; 2 - инфицирование микоплазмами; 3 - обработка жасмоновой кислотой. Слева от столбика 1 - молекулярные массы маркерных белков
с каллусной культурой сои [Гречкин, 1992; Гречкин и др., 1987].
Как известно, уровень фосфорилированности белков определяется активностью не только приходной протеин-киназной, но и расходной протеинфосфатазной реакции. В растениях обнаружены высокоактивные протеинфосфата-зы нескольких типов [MacKintosh, Cohen, 1989; Vera-Estrella et al., 1994; Xing et al., 1996], которые могут контролироваться с помощью различных эффекторов. Насколько большой вклад вносит активность фосфатаз в изменение уровня фосфорилированности полипептидов под влиянием ГДК, остается невыясненным.
Изменение спектров фосфорилированности белков является достаточно важным показателем активности интер-медиатов сигнального пути. Чаще изучается их влияние на синтез белков. Мы исследовали образование жасмонатин-дуцированных белков в сопоставлении с влиянием на этот процесс инфицирования растений микоплазмами Achole-plasma laidlawii 118 [Тарчевский и др., 19966].
Результатом действия на растения экзогенной жасмоновой кислоты (5 • К)-5 М) было увеличение поглощения 14С-лей-цина и включения радиоактивной метки в белки. Относительная доля включения 14С в белки от поглощения также возрастала. При разделении полипептидов с помощью электрофореза было обнаружено индуцированное жасмонатом образование двух новых полипептидов - 38 и 42 кДа (рис. 23).