Файл: tarchevskiy_i_a_signal_nye_sistemy_kletok_rasteniy.doc

ВУЗ: Не указан

Категория: Не указан

Дисциплина: Не указана

Добавлен: 01.12.2019

Просмотров: 3468

Скачиваний: 3

ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.

рис. 21). Недавно [Seo et al., 2001] был обнаружен еще один авто каталитический цикл, заключающийся в индукции ме-тилжасмонатом экспрессии гена метилтрансферазы (S-аде-нозил-метионин: жасмоновая кислота - карбоксил-метил-трансферазы), катализирующей реакцию метилирования жасмоновой кислоты.

Можно предположить, что промежуточные и конечные продукты липоксигеназного метаболизма активируют проте-инкиназы и, таким образом, осуществляют умножение сигна­ла и его передачу на геном растительных клеток. К сожале­нию, сведений об этом в литературе очень мало. Известно, что активировать мембраносвязанные протеинкиназы расте­ний способны оба типа продуктов реакции, катализируемой фосфолипазами А2, - как лизофосфолипиды (особенно, лизо-фосфатидилхолин и лизофосфатидная кислота), так и нена­сыщенные жирные кислоты [Scherer, 1996 a, b; Klucis, Polya, 1987; Lucantoni, Polya, 1987]. При этом лизофосфатидилглице-рол, лизофосфатидилсерин и лизофосфатидилэтаноламин не оказывают активирующего действия на протеинкиназы.

Несмотря на то что конкретные молекулярные меха­низмы активации генов различными оксилипинами еще не­достаточно изучены, можно утверждать, что они обладают способностью вызывать экспрессию генов, кодирующих белки, принимающие участие в повышении устойчивости растений к абиогенным стрессорам и в защитных реакциях против патогенов. Так, экзогенный жасмонат приводит к синтезу целого набора так называемых жасмонатиндуциру-емых белков [Mueller-Uri et al., 1988; Herrmann et al., 1989; Sembdner, Parthier 1993]. Среди них имеются ингибиторы протеиназ 1 и 2, ингибитор трипсина, тионин, напин, круци-ферин, вегетативные запасные белки, фенилаланин-аммо-ний-лиаза, халконсинтаза, липоксигеназа, полифенолокси-даза и др. Имеются данные [Farmer, Ryan, 1992], что не толь­ко жасмонат, но и его метаболические предшественники -13(8)-гидроперокси-9(г),(Е),15(Х)-октадекатриеновая кис­лота и 12-оксо-10,15(г)-фитодиеновая кислота - иницииру­ют образование стрессовых белков, в частности ингибито­ров протеиназ. Высказывается мнение [Parchmann et al., 1997], что 12-оксофитодиеновая кислота, проявляющая да­же большую активность в индукции защитных белков, чем жасмонат, является главным индуктором экспрессии генов

при местной реакции клеток на стрессоры, а за счет жасмо-ната и метилжасмоната обеспечивается передача сигнала в удаленные от места воздействия стрессора ткани и органы и формирование в них системного иммунитета. Это мнение подтверждается тем, что в отличие от жасмоната 12-оксо­фитодиеновая кислота не секретируется из культуры расти­тельных клеток в среду.

Обнаружено также, что летучие продукты липоксигеназ­ного метаболизма могут индуцировать (в том числе в сосед­них растениях) защитную реакцию. Так, т/?анс-2-гексеналь вызывал образование фенилаланин-аммоний-лиазы, катали-шрующей образование предшественников растительных ан­тибиотиков - фенилпропаноидных фитоалексинов. Показа­но [Fukuda et al., 1997], что 4-гидрокси-2-ноненаль индуциро­вал синтез глутатион-Б-трансферазы, участвующей в обез­вреживании токсичных для растений веществ.


Одно из свойств сигнальных систем - возможность тор­можения (прерывания) прохождения сигнала после того, как он был воспринят клеткой. Такая возможность была продемонстрирована и в отношении липоксигеназной сиг­нальной системы. Установлено [Avdiushko et al., 1995], что метилжасмонат активирует 13-гидропероксидлиазу; это приводит не только к усилению продукции бактерицидных и фунгицидных гексеналей, но соответственно к уменьше­нию доли метаболического потока, направляемого в сторо­ну жасмоната и метилжасмоната (эффект автоингибирова-н ия своего синтеза, проявляющийся, по-видимому, при дос­тижении пороговых концентраций метилжасмоната). Ока­залось, что дивиниловые эфиры - колнелевая и этеролевая кислоты - могут ингибировать активность липоксигеназ и таким образом затруднять функционирование липоксиге-пазной сигнальной системы [Corey et al., 1987]. Колнелевая кислота является активным ингибитором 9-липоксигеназы, j-геролевая кислота - 13-липоксигеназы [Гречкин, неопуб­ликованные данные]. Предполагается, что ингибирующее действие на липоксигеназную активность может также ока­зывать эпоксидный продукт превращения 9-гидроперокси-линолената [Sok, Kim, 1989].

Итак, результаты изучения сигнальных функций липок­сигеназного метаболизма позволяют считать, что ему при­сущи основные свойства, характерные и для других сиг-


нальных систем, - рецепция, преобразование и умножение сигнала, приводящие (при участии протеинкиназ) к экспрес­сии определенных генов и соответствующему ответу расти­тельной клетки.

В связи с тем что участие протеинкиназ является важ­нейшим звеном сигнальных систем клеток растений, осо­бую значимость приобретают данные о влиянии интермеди-атов липоксигеназного метаболизма на фосфорилирование белков растений [Каримова и др., 19996]. Показано, что эк­зогенная 12-гидроксидодеценовая кислота (ГДК) в неболь­ших концентрациях является очень активным стимулято­ром роста, более активным, чем травматин и жасмоновая кислота [Гречкин, 1992]. Поскольку нельзя было исклю­чить возможность участия ГДК в функционировании сиг­нальных систем, мы поставили перед собой задачу исследо­вать ее влияние на фосфорилирование белков, имея в виду, что протеинкиназные реакции являются важнейшим зве­ном всех известных сигнальных систем клеток.

ГДК в широком диапазоне концентраций (с максимумом при 10"7 М) вызывала значительное повышение содержа­ния радиоактивного фосфата во фракции растворимых бел­ков. Поскольку при гомогенизации листьев и в реакцион­ной смеси использовались неспецифические ингибиторы фосфатаз, эффект отщепления фосфата от белков в про­цессе обработки материала был минимальным. ГДК оказы­вала больший стимулирующий эффект на фосфорилирова­ние белков, чем такой известный эффектор протеинкиназ-ной активности, как цАМФ. Метилжасмонат также вызы­вал большее фосфорилирование белков, чем цАМФ, но меньшее, чем ГДК.

Результаты экспериментов по разделению фосфорили-рованных белков и определению их радиоактивности пока­зали, что обработка ГДК приводила к значительному повы­шению уровня фосфорилированности трех полипептидов низкой молекулярной массы (10-24 кДа) и высокомолеку­лярного полипептида 70 кДа (рис. 22). Из данных рисунка следует, что уровень радиоактивности отдельных полипеп­тидов (в области 40 кДа) был ниже в варианте с обработкой растений ГДК.

Фосфорилирование белков участвует в регуляции мно­жества процессов [Protein Phosphorylation in Plants, 1996].

Молекулярная масса белков, кДа

Рис. 22. Влияние 12-гидроксидодеценовой кислоты (ГДК) на фос-форилирование белков [Каримова и др., 19996] гомогената трехдневных растений гороха

1 - контроль; 2 - ГДК (0,1 мкМ). Рентгенограммы сканировали на денситографе ИФО-450. Стрелками указаны молекулярные массы бел­ков, радиоактивность которых подвергалась наибольшим изменениям

Получены данные о существовании в растениях различных типов протеинкиназ и об участии фосфорилирования бел­ков в экспрессии защитных генов после взаимодействия различных патогенов, элиситоров и стрессовых гормонов с клетками растений [Grab et al., 1985; Dietrich et al., 1990; Farmer et al., 1991; Bolwell et al., 1996]. О важной роли фос­форилирования белков в формировании устойчивости рас­тений к патогенам свидетельствуют данные о том, что не­которые клонированные гены, кодирующие защитные бел­ки растений, повышающие их устойчивость к инфицирова-


нию патогенами, имели большое сходство с генами, кодиру­ющими протеинкиназу [Martin et al., 1993]. Если роль в це­лом липоксигеназной системы в формировании защитного ответа растений достаточно известна, то данные о значи­тельном усилении фосфорилирования белков под влиянием промежуточного продукта липоксигеназного метаболизма (самой быстрой его ветви) получены [Каримова и др., 19996] впервые.

Тот факт, что под влиянием ГДК уровень фосфорилиро­ванности различных полипептидов изменился в разной сте­пени (см. рис. 22), свидетельствует в пользу того, что она может неодинаково влиять на активность ферментов (про-теинкиназ и протеинфосфатаз), определяющих баланс ско­ростей фосфорилирования и дефосфорилирования отдель­ных полипептидов.

Повышение уровня общего фосфорилирования белков под влиянием цАМФ не вызывает удивления, так как из­вестно существование цАМФ-активируемых протеинки-наз. Большее фосфорилирование белков под влиянием ме-тилжасмоната тоже объяснимо, так как известно, что жас-монат и метилжасмонат могут включать (пусть не полно­стью) ответную реакцию растений, характерную для меха­нического повреждения тканей или инфицирования пато­генами. Известно, что в этих случаях активируются сиг­нальные системы клеток, в том числе не только циклоаде-нилатная. Наибольшее фосфорилирование белков под вли­янием ГДК свидетельствует или о существовании активи­руемых непосредственно ГДК протеинкиназ, или о вклю­чении с помощью экзогенной ГДК совокупности сигналь­ных систем клеток, причем не только циклоаденилатной (поскольку цАМФ вызывал меньший эффект), но и каль­циевой, и НАДФ-оксидазной [Chandra, Low, 1995], и, воз­можно, "собственной" липоксигеназной системы. Факты такого влияния продуктов фосфолипазных и липоксиге-назных реакций обнаружены у животных [Гамалей, Клю-бин, 1996] и растительных [Гречкин, Тарчевский, 1999] клеток.

Выявлено [Гречкин и др., 1987], что ГДК является пре­обладающим продуктом метаболизации гидроперекисей линолевой и линоленовой кислот у бобовых. Высокая рост-стимулирующая активность 12-ГДК обнаружена в опытах


Рис. 23. Схема радиоавто­графов электрофореграмм белков, характеризующая влияние инфицирования микоплазмами и обработки жасмоновой кислотой на синтез полипептидов [Тар­чевский и др., 19966]

1 - контроль; 2 - инфици­рование микоплазмами; 3 - об­работка жасмоновой кисло­той. Слева от столбика 1 - мо­лекулярные массы маркерных белков

с каллусной культурой сои [Гречкин, 1992; Гречкин и др., 1987].

Как известно, уровень фосфорилированности белков определяется активностью не только приходной протеин-киназной, но и расходной протеинфосфатазной реакции. В растениях обнаружены высокоактивные протеинфосфата-зы нескольких типов [MacKintosh, Cohen, 1989; Vera-Estrella et al., 1994; Xing et al., 1996], которые могут контролиро­ваться с помощью различных эффекторов. Насколько большой вклад вносит активность фосфатаз в изменение уровня фосфорилированности полипептидов под влиянием ГДК, остается невыясненным.


Изменение спектров фосфорилированности белков яв­ляется достаточно важным показателем активности интер-медиатов сигнального пути. Чаще изучается их влияние на синтез белков. Мы исследовали образование жасмонатин-дуцированных белков в сопоставлении с влиянием на этот процесс инфицирования растений микоплазмами Achole-plasma laidlawii 118 [Тарчевский и др., 19966].

Результатом действия на растения экзогенной жасмоно­вой кислоты (5 • К)-5 М) было увеличение поглощения 14С-лей-цина и включения радиоактивной метки в белки. Относи­тельная доля включения 14С в белки от поглощения также возрастала. При разделении полипептидов с помощью элек­трофореза было обнаружено индуцированное жасмонатом образование двух новых полипептидов - 38 и 42 кДа (рис. 23).