ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 01.12.2019
Просмотров: 3437
Скачиваний: 3
гена (3-глюкуронидазы, введенного под промоторы двух изоформ супероксиддисмутазы [Tanaka et al., 1995], показало, что только одна из них активируется экзогенной абсци-зовой кислотой. При изучении особенностей экспрессии гена тримерной протеинфосфатазы типа 2А, играющей важную роль в регуляции функционирования сигнальных систем, GUS-метод позволил выяснить, что от набора каталитического и регуляторных субъединиц протеинфосфатазы зависит ее специфичность, активность и распределение внутри клетки [Thakore et al., 1999].
Для исследования роли ионов кальция в функционировании сигнальных систем используют трансгенные растения с привнесенным конститутивно экспрессируемым геном экворина (aequorin) [Knight et al., 1991; Chandra et al., 1997; и др.] - Са2+-зависимого флуоресцентного белка (из представителя кишечнополостных - Aequorea victoria), который образуется в результате посттранскрипционной модификации из предшественника - апоэкворина 22 кДа. Эк-ворин локализован в цитозоле клеток, и интенсивность его люминесценции в присутствии люминофора коэлентерази-на зависит от концентрации ионов кальция в этом компарт-менте. Найдена также принципиальная возможность размещения экворина в таких органоидах, как митохондрии и хлоропласты, с помощью конструирования химерных генов апоэкворина с прикрепленными к ним фрагментами, кодирующими синтез сигнальных последовательностей, от которых зависит транспорт белков в органоиды. Были найдены аналоги коэлентеразина, которые делают экворин более чувствительным и позволяют определять низкие концентрации ионов кальция [Knight et al., 1993].
Для исследования сигнальных систем клеток растений и особенностей взаимодействия патогенов и растений используют еще один репортерный ген из Aequorea victoria -ген так называемого зеленого флуоресцентного белка [Rossi et al., 1996; Liu, Kolattukudy, 1999; Liu et al., 2001]. Практикуется получение гетерорепортерных генных конструкций, кодирующих как этот белок, так и (3-глюкуро-нидазу, под промотором одного и того же гена [Quaedvlieg et al., 1998; Ottenschlager et al., 1999], что предоставляет дополнительные возможности исследования распределения и транспортировки белков, а также взаимоотношений па-
тогенов и растений. С помощью гена зеленого флуоресцентного белка, введенного в геном растений табака, удалось установить, что вирус мозаики табака транспортируется по растению с помощью двух различных механизмов - медленного, когда вирус передвигается от клетки к клетке, что сопровождается репликацией, и быстрого, осуществляющегося по сосудам растения [Casper, Holt, 1996]. Использование зеленого флуоресцентного белка под промотором белка движения вируса X картофеля позволило получить новую информацию о движении вирусов через плазмодесмы [Oparka et al., 1996].
В некоторых опытах определялась активность репор-терных генов хлорамфеникол-ацилтрансферазы, например, при исследовании особенностей действия патогенов и эли-ситоров на активность халконсинтазы [Loake et al., 1991; Yamada et al., 1994] - ключевого фермента синтеза фенил-пропаноидных фитоалексинов.
Использование репортерного гена люциферазы для ис-ледования сигнальных систем клеток растений поставлено под сомнение в связи с тем, что субстрат этого гена (люци-ферин) сам вызывает активацию генов защитных белков IJorda, Vera, 2000].
Трансгенные растения с репортерными генами достаточно часто конструируют для познания структуры промо-горных участков генов белков - участников сигнальных систем клеток растений, ферментов синтеза фитоалексинов и защитных белков.
Трансгенные растения с генами белков-элиситоров. Наибольшее число работ в этом направлении посвящено созданию более устойчивых растений с помощью переноса в них генов белков оболочки вирусов [Miller, Hemenway, 1998], элиситирующих включение сигнальных систем клеток путем взаимодействия с рецепторами (табл. 1) [Глагоц-кая и др., 1990а, б; Culver, Dawson, 1991; Lomonossoff, 1995; Bendahmane et al., 1997; Hammond, Dienelt, 1997; Lim et al., 1997; Moon et al., 1997; Seppanen et al., 1997; Watanabe et al., 1997; Chowrira et al., 1998; Guo et al., 1998; Lorito et al., 1998; Miller, Hemenway, 1998; Moreno et al., 1998; Ravelonandro et al., 1998; Reimann-Philipp, 1998; Beachy et al., 1999; Boria et al., 1999; Han et al., 1999; Jan et al., 1999; Keller et al., 1999; Kehm et al., 2001; Savenkov, Valkonen, 2001; Sunter et al.,
2001]; вирусных белков, обеспечивающих их транспортировку из клетки в клетку [Herbers et al., 1997; Seppanen et al., 1997; Spillane et al., 1997; Sanz et al., 2000; Kotlizky et al., 2001; Simone et al., 2001] и, наконец, вирусных репликаз и геликаз [Jones et al., 1998; Wittner et al., 1998; Erickson et al., 1999; Guo et al., 1999; Thomas et al., 2000; Vazquez et al., 2001], а также рибозимов [Kwon et al., 1997; Yang et al., 1997].
Сконструировано относительно мало трансгенных растений с генами белков элиситоров, продуцируемых патогенными грибами и бактериями. Из них особенно большое внимание исследователей привлекает криптогеин фитофторы [Lorito et al., 1998; Keller et al., 1999].
Трансгенные растения с генами белков, участвующих в синтезе стрессовых фитогормонов. Стрессовые фитогор-моны (абсцизовая, жасмоновая и салициловая кислоты, этилен, системин) могут рассматриваться в качестве соединений, элиситирующих сигнальные системы, поэтому представляют интерес работы, в которых приводятся данные о
трансгенных растениях с привнесенными генами белков, участвующих в образовании фитогормонов [Hedden, Phillips, 2000]: просистемина и системина [McGurl et al., 1992, 1994а], 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат-синтазы [С. Liu et al., 1998; De Martinis, Mariani, 1999] - одного из ферментов синтеза этилена, алленоксидсинтазы [Harms et al., 1995; С. Wang et al., 1999; Laudert et al., 2000], катализирующей образование предшественника жасмоната.
Трансгенные растения с генами белков - участников сигнальных систем. В настоящее время осуществлен перенос в растения генов белков, участвующих почти во всех этапах передачи сигнала от элиситоров до генома клеток. Получены трансгенные растения с рецепторным автоки-назным белком [Ohtake et al., 2000; Tao et al., 2000] и с рядом белков, принимающих участие в обслуживании сигнальных систем клеток. Одним из важнейших участников этих систем являются G-белки и протеинкиназы. Трансгенные растения с активным геном G-белка подтверждают это положение, обнаруживая повышенную устойчивость к вирусам [Sano et al., 1994; Sano, Ohashi, 1995; Li et al., 2001], так же как растения с привнесенным геном протеинкиназы |Morello et al., 2000]. Были получены трансгенные растения с привнесенным геном кальцийзависимой протеинкиназы [Romeis et al., 2000]. Обязательным участником сигнальных систем клеток являются факторы регуляции транскрипции, и трансгенные растения с активными генами этих белков обнаруживают повышенную устойчивость к патогенам |Mayda et al., 1999; Park et al., 2001]. Недавно было обнаружено, что при вирусной инфекции повышается активность гена РНК-зависимой РНК-полимеразы растения табака, что предположительно повышало устойчивость к вирусу. Использование трансгенных растений табака с антисмыс-ловым геном этого фермента показало, что у исследуемых растений наблюдалось нарушение защитных реакций и как локальное (в месте инфицирования), так и системное накопление вирусов [Xie et al., 2001].
Выше уже были охарактеризованы основные сигнальные системы клеток растений: аденилатциклазная, МАР-киназная, фосфатидатная, кальциевая, липоксигеназ-ная, супероксиддисмутазная (НАДФН-оксидазная), NO-син-тазная и протонная сигнальные системы.
Изменение работы МАР-киназной сигнальной системы и повышение устойчивости к стрессорам достигалась в трансгенных растениях с помощью гена МАРК [Seoa et al., 1999] или изоформы МАРККК, активируемой перекисью водорода [Kovtun et al., 2000], снижение интенсивности синтеза фосфатидной кислоты в фосфатидатной системе у ара-бидопсиса - с помощью антисмыслового подавления синтеза фосфолипазы Д [С. Wang, 2000]. В кальциевой сигнальной системе использовались трансгенные растения с анти-смысловым геном фосфолипазы С [Sanchez, Chua, 2001], привнесенными генами кальмодулина [Harding et al., 1997] и инозитол-5'-фосфатазы (снижающей содержание инози-толтрисфосфатов и инозитолтетракисфосфатов, что подавляет кальциевый сигнальный путь) [Berdy et al., 2001; Sanchez, Chua, 2001], в липоксигеназной - генами гидро-пероксидлиазы [Vancanneyt et al., 2001], образующей антипатогенные летучие С6-соединения, и алленоксидсинтазы [Harms et al., 1995], катализирующей образование фитодие-новой кислоты, из которой синтезируется жасмоновая кислота. Трансгенные растения арабидопсиса с привнесенным геном метилтрансферазы обнаруживали повышение устойчивости к патогенным грибам за счет усиления образования из жасмоновой кислоты подвижной стрессовой сигнальной молекулы метилжасмоната [Seo et al., 2001], что вызвало усиление формирования системного иммунитета.
Особенно много работ посвящено трансгенной модификации супероксидсинтазной сигнальной системы с помощью переноса генов супероксиддисмутазы [Van Camp et al., 1996; Chung et al., 2000; Pan et al., 2001], катал азы [Takahashi et al., 1997; Willekens et al., 1997; Chamnongpol et al., 1998; Mittler et al., 1999], аскорбатпероксидазы [Mittler et al., 1999] или гидроксилазы салициловой кислоты [Chamnongpol et al., 1998; Reuber et al., 1998; Kumar, Klessig, 2000; Lee et al., 2001; Yoshioka et al., 2001], катализирующей ее превращение в неактивный катехол. Как правило, генетическое вмешательство в функционирование НАДФН-оксидазной системы приводило к изменениям в вызванном патогенами апоптозе клеток. Трансгенные растения табака с перенесенным в них геном подавления апоптоза животных проявляли большую устойчивость к вирусу табачной мозаики [Mitsuhara et al., 1999; Dickman et al., 2001], что еще раз свидетельствует об
общности механизмов апоптоза и его участников. Ингибитор апоптоза животных клеток оказывал аналогичное действие и на клетки арабидопсиса [Kawai-Yamada et al., 2001]. На протекание апоптоза и устойчивость к патогенам может оказывать влияние активность не только супероксидисму-тазы и каталазы, но и ферментов, от которых также зависит окислительно-восстановительный режим клеток — цис-теин-пероксиредоксина и глутатион-пероксидазы, о чем свидетельствуют трансгенные растения с генами этих ферментов [Lee et al., 2000; Roxas et al., 2000]. Интересны результаты опытов с катионной пероксидазой растений, показавшие, что ее свойства можно изменять с помощью направленной генетической замены одной из трех гликозили-рующихся аминокислот [Lige et al., 2001].
В связи с тем, что Н+-АТФаза, по-видимому, играет важную роль в функционировании протонной сигнальной системы [Schaller, (Decking, 1999], представляют интерес данные о повышении устойчивости растений к грибам и бактериям после введения в них гена бактериородопсина из Halobacterium halobium [Mittler et al., 1995; Abad et al., 1997; Rizhsky, Mittler, 2001], выполняющего функции протонной помпы, как было показано в серии работ В.П. Скулачева, доказавшего с помощью этого объекта справедливость представлений о трансмембранном протонном градиенте как предшественнике АТФ.
Трансгенные растения с генами фенилпропаноидного и терпеноидного метаболизма. Как известно, в результате включения сигнальных систем образуются растительные антибиотики - фитоалексины, относящиеся главным образом к соединениям фенилпропаноидного и терпеноидного метаболизма клеток. Имеется несколько удачных попыток повышения устойчивости растений с помощью привнесения генов ферментов синтеза фенилпропаноидных [Hain et al., 1993; Maher et al., 1994; Oommenet et al., 1994; Colliver et al., 1997; Coutos-Thevenot et al., 2001; Jones et al., 2001] и терпеноидных [Kunkel et al., 1999; Ouwerkerk et al., 1999] фитоалексинов. К этому направлению работ примыкает усиление лигнифи-кации клеток с помощью гена пероксидазы [Dowd et al., 1998; Ostergaard et al., 2000], катализирующей превращение мономерных производных фенилпропаноидного метаболизма (фенольных кислот и спиртов) в гетерополимер лигнин.