гена (3-глюкуронидазы, введенного под промоторы двух изоформ супероксиддисмутазы [Tanaka et al., 1995], показа­ло, что только одна из них активируется экзогенной абсци-зовой кислотой. При изучении особенностей экспрессии ге­на тримерной протеинфосфатазы типа 2А, играющей важ­ную роль в регуляции функционирования сигнальных сис­тем, GUS-метод позволил выяснить, что от набора катали­тического и регуляторных субъединиц протеинфосфатазы зависит ее специфичность, активность и распределение внут­ри клетки [Thakore et al., 1999].

Для исследования роли ионов кальция в функциониро­вании сигнальных систем используют трансгенные расте­ния с привнесенным конститутивно экспрессируемым ге­ном экворина (aequorin) [Knight et al., 1991; Chandra et al., 1997; и др.] - Са²⁺-зависимого флуоресцентного белка (из представителя кишечнополостных - Aequorea victoria), ко­торый образуется в результате посттранскрипционной мо­дификации из предшественника - апоэкворина 22 кДа. Эк-ворин локализован в цитозоле клеток, и интенсивность его люминесценции в присутствии люминофора коэлентерази-на зависит от концентрации ионов кальция в этом компарт-менте. Найдена также принципиальная возможность раз­мещения экворина в таких органоидах, как митохондрии и хлоропласты, с помощью конструирования химерных генов апоэкворина с прикрепленными к ним фрагментами, коди­рующими синтез сигнальных последовательностей, от ко­торых зависит транспорт белков в органоиды. Были найде­ны аналоги коэлентеразина, которые делают экворин более чувствительным и позволяют определять низкие кон­центрации ионов кальция [Knight et al., 1993].

Для исследования сигнальных систем клеток растений и особенностей взаимодействия патогенов и растений ис­пользуют еще один репортерный ген из Aequorea victoria -ген так называемого зеленого флуоресцентного белка [Rossi et al., 1996; Liu, Kolattukudy, 1999; Liu et al., 2001]. Практикуется получение гетерорепортерных генных кон­струкций, кодирующих как этот белок, так и (3-глюкуро-нидазу, под промотором одного и того же гена [Quaedvlieg et al., 1998; Ottenschlager et al., 1999], что предоставляет до­полнительные возможности исследования распределения и транспортировки белков, а также взаимоотношений па-

тогенов и растений. С помощью гена зеленого флуорес­центного белка, введенного в геном растений табака, уда­лось установить, что вирус мозаики табака транспортиру­ется по растению с помощью двух различных механиз­мов - медленного, когда вирус передвигается от клетки к клетке, что сопровождается репликацией, и быстрого, осу­ществляющегося по сосудам растения [Casper, Holt, 1996]. Использование зеленого флуоресцентного белка под про­мотором белка движения вируса X картофеля позволило получить новую информацию о движении вирусов через плазмодесмы [Oparka et al., 1996].

В некоторых опытах определялась активность репор-терных генов хлорамфеникол-ацилтрансферазы, например, при исследовании особенностей действия патогенов и эли-ситоров на активность халконсинтазы [Loake et al., 1991; Yamada et al., 1994] - ключевого фермента синтеза фенил-пропаноидных фитоалексинов.

---

Использование репортерного гена люциферазы для ис-ледования сигнальных систем клеток растений поставлено под сомнение в связи с тем, что субстрат этого гена (люци-ферин) сам вызывает активацию генов защитных белков IJorda, Vera, 2000].

Трансгенные растения с репортерными генами доста­точно часто конструируют для познания структуры промо-горных участков генов белков - участников сигнальных си­стем клеток растений, ферментов синтеза фитоалексинов и защитных белков.

Трансгенные растения с генами белков-элиситоров. На­ибольшее число работ в этом направлении посвящено соз­данию более устойчивых растений с помощью переноса в них генов белков оболочки вирусов [Miller, Hemenway, 1998], элиситирующих включение сигнальных систем кле­ток путем взаимодействия с рецепторами (табл. 1) [Глагоц-кая и др., 1990а, б; Culver, Dawson, 1991; Lomonossoff, 1995; Bendahmane et al., 1997; Hammond, Dienelt, 1997; Lim et al., 1997; Moon et al., 1997; Seppanen et al., 1997; Watanabe et al., 1997; Chowrira et al., 1998; Guo et al., 1998; Lorito et al., 1998; Miller, Hemenway, 1998; Moreno et al., 1998; Ravelonandro et al., 1998; Reimann-Philipp, 1998; Beachy et al., 1999; Boria et al., 1999; Han et al., 1999; Jan et al., 1999; Keller et al., 1999; Kehm et al., 2001; Savenkov, Valkonen, 2001; Sunter et al.,

---

2001]; вирусных белков, обеспечивающих их транспорти­ровку из клетки в клетку [Herbers et al., 1997; Seppanen et al., 1997; Spillane et al., 1997; Sanz et al., 2000; Kotlizky et al., 2001; Simone et al., 2001] и, наконец, вирусных репликаз и геликаз [Jones et al., 1998; Wittner et al., 1998; Erickson et al., 1999; Guo et al., 1999; Thomas et al., 2000; Vazquez et al., 2001], а также рибозимов [Kwon et al., 1997; Yang et al., 1997].

Сконструировано относительно мало трансгенных рас­тений с генами белков элиситоров, продуцируемых пато­генными грибами и бактериями. Из них особенно большое внимание исследователей привлекает криптогеин фито­фторы [Lorito et al., 1998; Keller et al., 1999].

Трансгенные растения с генами белков, участвующих в синтезе стрессовых фитогормонов. Стрессовые фитогор-моны (абсцизовая, жасмоновая и салициловая кислоты, эти­лен, системин) могут рассматриваться в качестве соедине­ний, элиситирующих сигнальные системы, поэтому пред­ставляют интерес работы, в которых приводятся данные о

трансгенных растениях с привнесенными генами белков, участвующих в образовании фитогормонов [Hedden, Phillips, 2000]: просистемина и системина [McGurl et al., 1992, 1994а], 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат-синтазы [С. Liu et al., 1998; De Martinis, Mariani, 1999] - одного из ферментов синтеза этилена, алленоксидсинтазы [Harms et al., 1995; С. Wang et al., 1999; Laudert et al., 2000], катализирующей об­разование предшественника жасмоната.

Трансгенные растения с генами белков - участников сигнальных систем. В настоящее время осуществлен пере­нос в растения генов белков, участвующих почти во всех этапах передачи сигнала от элиситоров до генома клеток. Получены трансгенные растения с рецепторным автоки-назным белком [Ohtake et al., 2000; Tao et al., 2000] и с рядом белков, принимающих участие в обслуживании сигнальных систем клеток. Одним из важнейших участников этих сис­тем являются G-белки и протеинкиназы. Трансгенные рас­тения с активным геном G-белка подтверждают это поло­жение, обнаруживая повышенную устойчивость к вирусам [Sano et al., 1994; Sano, Ohashi, 1995; Li et al., 2001], так же как растения с привнесенным геном протеинкиназы |Morello et al., 2000]. Были получены трансгенные растения с привнесенным геном кальцийзависимой протеинкиназы [Romeis et al., 2000]. Обязательным участником сигнальных систем клеток являются факторы регуляции транскрипции, и трансгенные растения с активными генами этих белков обнаруживают повышенную устойчивость к патогенам |Mayda et al., 1999; Park et al., 2001]. Недавно было обнару­жено, что при вирусной инфекции повышается активность гена РНК-зависимой РНК-полимеразы растения табака, что предположительно повышало устойчивость к вирусу. Использование трансгенных растений табака с антисмыс-ловым геном этого фермента показало, что у исследуемых растений наблюдалось нарушение защитных реакций и как локальное (в месте инфицирования), так и системное накоп­ление вирусов [Xie et al., 2001].

Выше уже были охарактеризованы основные сигналь­ные системы клеток растений: аденилатциклазная, МАР-киназная, фосфатидатная, кальциевая, липоксигеназ-ная, супероксиддисмутазная (НАДФН-оксидазная), NO-син-тазная и протонная сигнальные системы.

---

Изменение работы МАР-киназной сигнальной системы и повышение устойчивости к стрессорам достигалась в трансгенных растениях с помощью гена МАРК [Seoa et al., 1999] или изоформы МАРККК, активируемой перекисью водорода [Kovtun et al., 2000], снижение интенсивности син­теза фосфатидной кислоты в фосфатидатной системе у ара-бидопсиса - с помощью антисмыслового подавления синте­за фосфолипазы Д [С. Wang, 2000]. В кальциевой сигналь­ной системе использовались трансгенные растения с анти-смысловым геном фосфолипазы С [Sanchez, Chua, 2001], привнесенными генами кальмодулина [Harding et al., 1997] и инозитол-5'-фосфатазы (снижающей содержание инози-толтрисфосфатов и инозитолтетракисфосфатов, что подав­ляет кальциевый сигнальный путь) [Berdy et al., 2001; Sanchez, Chua, 2001], в липоксигеназной - генами гидро-пероксидлиазы [Vancanneyt et al., 2001], образующей анти­патогенные летучие С₆-соединения, и алленоксидсинтазы [Harms et al., 1995], катализирующей образование фитодие-новой кислоты, из которой синтезируется жасмоновая кис­лота. Трансгенные растения арабидопсиса с привнесенным геном метилтрансферазы обнаруживали повышение устой­чивости к патогенным грибам за счет усиления образования из жасмоновой кислоты подвижной стрессовой сигнальной молекулы метилжасмоната [Seo et al., 2001], что вызвало усиление формирования системного иммунитета.

Особенно много работ посвящено трансгенной модифи­кации супероксидсинтазной сигнальной системы с помо­щью переноса генов супероксиддисмутазы [Van Camp et al., 1996; Chung et al., 2000; Pan et al., 2001], катал азы [Takahashi et al., 1997; Willekens et al., 1997; Chamnongpol et al., 1998; Mittler et al., 1999], аскорбатпероксидазы [Mittler et al., 1999] или гидроксилазы салициловой кислоты [Chamnongpol et al., 1998; Reuber et al., 1998; Kumar, Klessig, 2000; Lee et al., 2001; Yoshioka et al., 2001], катализирующей ее превращение в не­активный катехол. Как правило, генетическое вмешатель­ство в функционирование НАДФН-оксидазной системы приводило к изменениям в вызванном патогенами апоптозе клеток. Трансгенные растения табака с перенесенным в них геном подавления апоптоза животных проявляли большую устойчивость к вирусу табачной мозаики [Mitsuhara et al., 1999; Dickman et al., 2001], что еще раз свидетельствует об

общности механизмов апоптоза и его участников. Ингиби­тор апоптоза животных клеток оказывал аналогичное дейст­вие и на клетки арабидопсиса [Kawai-Yamada et al., 2001]. На протекание апоптоза и устойчивость к патогенам может оказывать влияние активность не только супероксидисму-тазы и каталазы, но и ферментов, от которых также зави­сит окислительно-восстановительный режим клеток — цис-теин-пероксиредоксина и глутатион-пероксидазы, о чем свидетельствуют трансгенные растения с генами этих фер­ментов [Lee et al., 2000; Roxas et al., 2000]. Интересны результаты опытов с катионной пероксидазой растений, по­казавшие, что ее свойства можно изменять с помощью на­правленной генетической замены одной из трех гликозили-рующихся аминокислот [Lige et al., 2001].

---

В связи с тем, что Н⁺-АТФаза, по-видимому, играет важ­ную роль в функционировании протонной сигнальной сис­темы [Schaller, (Decking, 1999], представляют интерес дан­ные о повышении устойчивости растений к грибам и бакте­риям после введения в них гена бактериородопсина из Halobacterium halobium [Mittler et al., 1995; Abad et al., 1997; Rizhsky, Mittler, 2001], выполняющего функции протонной помпы, как было показано в серии работ В.П. Скулачева, доказавшего с помощью этого объекта справедливость представлений о трансмембранном протонном градиенте как предшественнике АТФ.

Трансгенные растения с генами фенилпропаноидного и терпеноидного метаболизма. Как известно, в результате включения сигнальных систем образуются растительные ан­тибиотики - фитоалексины, относящиеся главным образом к соединениям фенилпропаноидного и терпеноидного мета­болизма клеток. Имеется несколько удачных попыток повы­шения устойчивости растений с помощью привнесения генов ферментов синтеза фенилпропаноидных [Hain et al., 1993; Maher et al., 1994; Oommenet et al., 1994; Colliver et al., 1997; Coutos-Thevenot et al., 2001; Jones et al., 2001] и терпеноидных [Kunkel et al., 1999; Ouwerkerk et al., 1999] фитоалексинов. К этому направлению работ примыкает усиление лигнифи-кации клеток с помощью гена пероксидазы [Dowd et al., 1998; Ostergaard et al., 2000], катализирующей превращение моно­мерных производных фенилпропаноидного метаболизма (фенольных кислот и спиртов) в гетерополимер лигнин.

---

Смотрите также файлы

• Элементарная ботаника (ЭБ3) (ПВ+).doc

• Элементарная ботаника (ЭБ1) (ЗО).doc

• Положення+правки-3.doc

• metodichka_z_selektsiyi (1).doc

• moy_otchet.doc