ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 02.12.2019
Просмотров: 267
Скачиваний: 1
Практичне заняття №2
Тема: Поживні мікробіологічні середовища, методи їх приготування та стерилізація
Мета роботи: Ознайомити студентів з поживними середовищами, які використовуються в бактеріологічній лабораторії методами приготування і їх стерилізації.
Матеріали та обладнання: Поживні середовища, електронні ваги, водяна баня, чашки Петрі, пергаментний папір, автоклав.
Хід роботи:
Основні живильні середовища.
Численні потреби мікроорганізмів зумовлюють велике розмаїття живильних середовищ, а для окремих видів бактерій існують спеціальні середовища. Частину їх готують у лабораторіях безпосередньо перед посівом, але з кожним роком з’являються все нові й нові середовища заводського виготовлення (сухі), які здатні задовольнити найвибагливіші потреби мікробіологів. Вони зберігаються тривалий час, мають стандартний склад. Сухі поживні середовища представляють гігроскопічні порошки, що розчиняються у воді. Разом зі звичайним середовищем - м'ясо-пептоним агаром виробляється багато спеціальних поживних середовищ складного рецептурного складу для вирощування мікробів кишкової полички, (наприклад середовища Ендо), сухий бактоагар Плоскирева. Консервовані поживні середовища поступають в скляних банках з пластмасовими кришками, що щільно загвинчуються і забезпечують стерильність. В такому ж вигляді вони повинні зберігатися і в лабораторії.
Середовища поділяються на природні й штучні. Як природні використовують згорнуту сироватку, молоко, яйця, м’язову тканину. Штучні середовища створюють шляхом комбінування різноманітних субстратів, що забезпечують ті чи інші потреби мікроорганізмів. Їх використовують в основному для експериментального вивчення окремих ланок метаболізму бактерій.
Залежно від своєї густини, середовища поділяються на рідкі, напіврідкі та щільні. Напіврідкі та щільні середовища готуються з рідких, додаючи відповідно 0,3-0,7 % та 1,5-2,0 % агару. Останній представляє собою волокнистий матеріал, який добувають з морських водоростей. Складається він з полісахаридів (70-75 %), білків (2-3 %), основними складниками є високомолекулярні агароза та агаропептин. Агар розчиняється у воді при підвищеній температурі, а, застигаючи, надає середовищу драглеподібної консистенції та стійкості до ферментних систем бактерій. Саме за ці властивості він набув широкого розповсюдження у мікробіологічній практиці. Для створення щільних середовищ використовують також желатин (10-15 %), згорнуту сироватку крові. Поживні середовища служать для виділення з матеріалу, що досліджується чистих культур мікробів та вивчення їх властивостей. Поживні середовища є основою бактеріологічних робіт, що часто визначають своєю якістю результати досліджень.
До складу середовищ, що застосовуються для вирощування бактерій, входять необхідні для побудови білків цитоплазми органогени: азот, вуглець, водень, кисень; неорганічні сполуки, що включають фосфор, калій, сірку, натрій, магній, залізо, кобальт, йод, марганець, бор, цинк, молібден, мідь і др.
Усі перераховані елементи повинні знаходитись в поживному середовищі в сприятливому для засвоєння даним мікроорганізмом сполученні, причому вимоги різних мікробів в цьому відношенні різноманітні. Джерелом вуглецю є головним чином різні вуглеводи: цукор, багатоатомні спирти, органічні кислоти та їх солі. Потреба бактерій в неорганічних елементах задовольняється додаванням у поживні середовища солей: NaCl, KH2PO4 K2HPO4 і др. Мікроелементи, що виконують роль каталізаторів хімічних процесів, необхідні в дуже малих кількостях і поступають в поживне середовище з пептоном, неорганічними солями і водою. Разом з перерахованими органічними і неорганічними елементами бактеріям необхідні ростові фактори, що за своєю роллю відповідають вітамінам тварин, це продукти рослинного і тваринного походження , що в своєму складі мають нікотинову, пантотенову, пара-бензойну кислоти, вітаміни А, В, С. і др. Поживні речовини можуть засвоюватися мікробами тільки при визначеній реакції поживного середовища, так як проникливість оболонок мікробних клітин змінюється в залежності від pH середовища.
Вимоги до приготування поживних середовищ
Для вирощування бактерій у лабораторних умовах, дослідження їх різноманітних властивостей, тривалого зберігання використовують живильні середовища. Вони повинні відповідати певним стандартам, створюючи оптимальні умови для росту, розмноження й життєдіяльності мікроорганізмів.
У першу чергу, бактерії потребують азоту, вуглецю та водню для побудови власних білків. Водень і кисень для клітин постачає вода. Джерелом азоту виступають численні речовини, в основному, тваринного походження (м’ясо яловиче, риба, м’ясо-кісткова мука, казеїн), а також білкові гідролізати, пептиди, пептони. Можна використовувати й замінники м’яса – плаценту, кров’яні згустки, дріжджі. Отже, до складу середовищ повинні бути введені джерела живильних речовин і вода, а також ростові фактори (вітаміни групи В, ферменти). Універсальним джерелом їх служать екстракти з білків тваринного й рослинного походження, білкові гідролізати. Для мікробів з більш складними харчовими потребами до складу середовищ включають нативні субстрати – кров, сироватку, асцитичну рідину, яєчний жовток, шматочки печінки, нирок, мозкової тканини та ін.
Середовища повинні бути збалансованими за мікроелементним складом і містити іони заліза, міді, марганцю, цинку, кальцію, натрію, калію, мати у своєму складі неорганічні фосфати.
Допускається застосування речовин, які усувають дію інгібіторів росту і токсиноутворення мікробів (окремі амінокислоти, активоване вугілля тощо). Важливим є стабілізація оптимуму рН середовища, його високої буферності та рівень окисно-відновного потенціалу (Еh), який для аеробних мікроорганізмів досягає понад 0,08 В, а для анеробних бактерій коливається в межах 0,12-0,60 В. Середовища повинні мати певну в’язкість, густину, мати певну вологість (до 20 % води), бути ізотонічними, прозорими й обов’язково стерильними.
Основні групи живильних середовищ
Залежно від потреб бактеріологів живильні середовища поділяються на п’ять основних груп.
Перша група – універсальні (прості) середовища. До них належать м’ясо-пептонний бульйон (МПБ) та м’ясо-пептонний агар (МПА). За своїм складом, наявністю живильних речовин вони придатні для культивування багатьох видів бактерій.
Друга група – спеціальні середовища. Вони використовуються в тих випадках, коли мікроорганізми не ростуть на простих. До них належить кров’яний, сироватковий агари, сироватковий бульйон, асцитичний бульйон, асцит-агар та інші.
Третя група – елективні середовища, на яких мікроорганізми певного виду ростуть швидше, більш інтенсивно, опереджають у своєму розвитку інші види бактерій. Наприклад, 1 % лужна пептонна вода є елективним середовищем для холерних вібріонів, середовища Ру та Леффлера – для збудників дифтерії.
Четверта група – селективні середовища, які завдяки додаванню певних компонентів (жовч, фарби, антибіотики та ін.) здатні пригнічувати розвиток одних видів мікроорганізмів, але не впливають на інші види. так, середовище Мюллера є селективним для тифо-паратифозних бактерій, фуразолідоно-твіновий агар – для коринебактерій і мікрококів. Додавання антибіотиків до складу середовищ робить їх селективними для грибів (напр. середовище Сабуро та ін.).
П’ята група – диференціально–діагностичні середовища. Це велика група середовищ, які дозволяють визначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів і проводити їх диференціацію. Вони поділяються на середовища для визначення протеолітичних, пептолітичних, цукролітичних, гемолітичних, ліполітичних, редукуючих властивостей (середовища Ендо, Левіна, Плоскірєва, Гісса).
Поживні середовища поділяються на середовища загального призначення і спеціальні. До першої групи належать м'ясо-пептоні: агар, бульйон, поживна желатина.
До спеціальних поживних середовищ відносяться елективні (избирательные) середовища та диференційно-діагностичні поживні середовища.
Класифікація поживних середовищ
|
Універсальні: ПВ, МПБ, МПА
Спеціальні: цукровий МПА, МПБ, сироватковий МПА, кров’яний МПА, асцититичний МПА
Елективні: Ру, Леффлера, 1% лужна ПВ
Селективні: Середовище Мюллера, фуразолідоно-твіновий агар, Сабуро
Диференціально-діагностичні:
1) для визначення цукролітичних властивостей (середовища Гіса, Ендо, Левіна, Плоскірева)
2) для визначення протеолітичних властивостей (згорнута сироватка, МПЖ, кусочки м’язів, білка курячого яйця)
3) для визначення пептолітичних властивостей (МПБ, ПВ)
4) для визначення гемолітичних властивостей (кров’ний МПА)
для визначення редукуючих властивостей (середовища з різними барвниками) |
Основні методи приготування поживних середовищ.
А). М'ясо-пептонний бульйон.
Вихідним матеріалом для приготування м'ясо-пептонних середовищ є м'ясна вода.
М'ясна вода. Свіже м'ясо – яловичину, телятину, конину – звільнюють від жиру, сухожиль і пропускають через м’ясорубку; 500 г фаршу заливають 1 л. водопровідної води, настоюють 16-24 години в прохолодному місці (4-6 градусів). М'ясний настій зливають, віджимають м'ясо, кип’ятять на слабкому вогні, а потім фільтрують через паперовий фільтр. Прозору, солом'яно- жовтого кольору рідину зливають у вимірювальний циліндр, доливають водопровідною водою до необхідного об'єму.
Отриману таким чином м'ясну воду стерилізують у склянках, закритих ватно-марлевими пробками, 20 хвилин при температурі 120 градусів або дрібно текучим паром. Стерильна м'ясна вода є основою для приготування багатьох поживних середовищ, може зберігатися довгий час.
М'ясо-пептонний бульйон готують на м'ясній воді. До теплої м'ясної води додають 10 г (1 %) пептону, 5 г (0,5 %) повареної солі і кип’ятять 10-15 хвилин на слабкому вогні при постійному перемішуванні. Після остигання приготованого бульйону встановлюють pH 7,0 – 7,2. Бульйон фільтрують, розливають у колби чи пробірки, стерилізують 20 хвилин при температурі 120 градусів.
Б). М'ясо-пептоний агар.
До 1 л м'ясо-пептонного бульйону добавляють 15 – 25 г (1,5 – 2,5 %) дрібно нарізаного і добре промитого агар-агару. Постійно перемішуючи, на слабкому вогні, бульйон з агаром доводять до кипіння, агар при цьому повинен повністю розчинитися. Встановлюючи необхідне значення pH (звичайно 7,0 – 7,2). У випадку помутніння середовища його освітлюють білком, фільтрують, розливають у пробірки чи колби і стерилізують у автоклаві 15-20 хвилин при температурі 120 градусів.
В). М'ясо-пептона желатина.
До м'ясо-пептонного бульйону додають 10-15 % (в теплий період року концентрацію желатини збільшують) дрібно нарізаної желатини і розчиняють, нагріваючи на водяній бані при температурі 40-50 градусів. Встановлюють pH 7,0 – 7,4. Розтоплену желатину фільтрують крізь паперовий фільтр (желатина фільтрується дуже повільно). Профільтроване середовище розливають у пробірки так, щоб не забруднити зсередини їх краї. Розлите по пробірках середовище стерилізують дрібно 3 дні по 1 годині при температурі 100 градусів. При сильному перегріванні желатина втрачає властивість застигати.
Фільтрування поживних середовищ.
Рідкі і желатинізовані поживні середовища фільтрують крізь фільтрувальний папір, середовища з агаром – крізь ватно-марлевий фільтр загальноприйнятим способом. Перед фільтруванням монтують допоміжну установку. В кільце універсального штативу закріплюють воронку, під трубку воронки підставляють приймальник для фільтрату.
Ватно-марлеві фільтри для агарових середовищ готовлять наступним чином. Скляну воронку вкривають квадратним куском марлі, кути якої перегинають крізь край воронки. На марлю кладуть шар гігроскопічної вати. Перед початком фільтрування поверхню ватно-марлевого фільтру , так же як і паперового, обережно змочують дистильованою водою чи середовищем, що фільтрується.
Фільтрування при нагріванні. Поживні середовища з желатиною та агаром фільтрують, расплавивши і підігрівши до кипіння, так як з підвищенням температури знижується в’язкість рідини і процес фільтрації проходить швидше. Фільтрування з підігріванням краще проводити в гарячому автоклаві, відкривши кришку і виключивши джерело нагрівання.
Освітлення поживних середовищ.
Освітлення поживних середовищ застосовують у тих випадках, коли в процесі приготування вони мутніють і набувають темного кольору. Воно може бути засноване на коагуляції завислих частинок, що сприяє більш швидкому випадінню їх у осадок, і їх адсорбції, тобто властивості різних речовин осаджувати на свою поверхню завислі частинки.
Розливання поживних середовищ.
Після освітлення і фільтрації поживні середовища розливають у колби, флакони, пробірки чи матраци. В пробірки поживні середовища наливають по 4-5 чи 10 мл, у флакони і колби – по 50, 100 і 200 мл.
Середовища, стерильні і ті, що стерилізуються текучим паром чи під тиском 0,5 атм., розливають у стерильний посуд; середовища, що будуть стерилізуватися під тиском 1 атм., - у чистий, але не стерильний посуд. Для розливання рідких поживних середовищ використовують такі установки.
-
На кінець воронки закріпленої у кільце штатива, надівають гумову трубку, що закінчується скляним наконечником. На резинову трубку накладають затискувач Мора. Під воронку підставляють сосуд для приймання профільтрованого середовища.
-
Для відмірювання і розливання визначених об’ємів середовища користуються градуйованою бюреткою або збирають спеціальну установку. Скляну воронку і градуйовану бюретку поєднують гумовими трубками з двома колінами скляного трійника, на його третє коліно одягають гумову трубку, що закінчується скляним наконечником. На гумові трубки, що з’єднують воронку з трійником, на трійник і наконечник накладають затискачі Мора. Ослаблюючи перший затискач, наповнюють градуйований циліндр рідиною, відкривши другий затискач, випускають відміряну кількість рідини у посудину для поживного середовища. Перші порції рідини до витиснення повітря з трубок не враховуються,
При розливанні середовищ, краї посуду не можна змочувати поживним середовищем, так як ватно-марлеві пробки, приклеюються до скла під час стерилізації і потім важко виймаються.
Висновок: Таким чином матеріали роботи практичного заняття №2 дали можливість засвоїти:
-
Основні поживні середовища, їх класифікацію та склад.
-
Вимоги до приготування поживних середовищ.
-
Призначення поживних середовищ.
-
Основні методи приготування поживних середовищ.
-
Техніку фільтрування, освітлення, розливання та стерилізацію поживних середовищ.