Для тест-систем ИФА важным условием эффективного использования является качество АГ ВИЧ. Часто применяются вирусные лизаты, однако более предпочтительны наборы с иммобилизацией рекомбинантных вирусных белков, позволяющие повысить чувствительность и специфичность теста. Существует четыре поколения тест-систем ИФА:

·        первое поколение (лизатные тесты): на стенки лунок пластикового планшета в качестве АГ иммобилизированы лизаты культуры лимфоцитов, зараженных ВИЧ;

·        второе поколение: в качестве АГ на планшетах используются рекомбинантные белки и/или пептиды; определяются АТ как к ВИЧ-1, так и к ВИЧ-2, эти наборы более специфичны, чем тест-системы первого поколения, чувствительность – та же;

·        третье поколение: тесты на основе рекомбинантных белков и/или синтетических пептидов; определяются IgM и IgG к ВИЧ, улучшена чувствительность и специфичность (не менее 95–97%);

·        четвертое поколение: совмещенные тесты с иммобилизацией АГ и рекомбинантных АТ. Тест-системы позволяют определять р24-АГ и АТ к нему, чувствительность и специфичность – не менее 99%.

Тесты ИФА третьего и особенно четвертого поколения позволяют сократить интервал времени от момента инфицирования пациента до момента возможности выявления АТ (высокочувствительные тест-системы). При тестировании образцов крови в тест-системах ИФА преследуются три цели:

·        обеспечение безопасности трансфузии крови и ее препаратов;

·        эпиднадзор, мониторирование распространенности ВИЧ-инфекции;

·        диагностика ВИЧ-инфекции.

Чувствительность наборов ИФА

Чувствительность наборов ИФА находится в пределах 93–99%; большинство тест-систем ИФА для определения АТ к ВИЧ, выпускаемых в странах Западной Европы, имеют чувствительность около 99%. - Алгоритм диагностики ВИЧ инфекции методом ИФА представлен на рис. 1. Результаты ИФА интерпретируются как положительные, отрицательные и неопределенные. ВОЗ рекомендует проводить дополнительный тест использованием тест-наборов ИФА с отличающейся антигенной специфичностью. Подтверждающим тестом положительных реакций в ИФА является ИБ.



Рис. 1 - Алгоритм диагностики ВИЧ-инфекции.

Диагностика ВИЧ-инфекции в центрах по профилактике и борьбе со СПИДом осуществляется в два этапа: первичный скрининг – ИФА в планшетном формате; подтверждение первичного положительного результата методом ИБ. Тест-системы ИФА–ВИЧ–АТ/АГ позволяют одновременно выявить суммарные АТ к отдельным белкам ВИЧ-1, ВИЧ-2 и АГ р24 ВИЧ. На стенки лунок пластиковых планшетов иммобилизированы рекомбинантные АГ (gр120, gр41, gр36, р24, р31) и отдельно – моноклональные АТ к АГ ВИЧ-1 р24. Тест-системы содержат белковые компоненты ВИЧ-1 трех групп: env (gp41, gp120); gag (p24); pol (p31) и АГ gp36 ВИЧ-2. ИФА-диагностикумы ИФА–ВИЧ–АТ/АГ могут быть использованы для проведения дифференциальных исследований при получении положительных результатов скрининга в тест-системах, выявляющих комплекс АГ–АТ. Возможность определения АГ р24 ВИЧ-1 раздельно и одновременно с АТ к ВИЧ позволяет сократить сроки установления клинического диагноза.

---

Экспресс-методы в диагностике ВИЧ-инфекции

В последнее время часто стали широко использоваться экспресс-методы диагностики, основанные на принципах ИФА. При работе с большинством наборов результаты могут быть получены в течение 10–15 мин.

Методы экспресс-диагностики ВИЧ подразделяются на 3 группы:

• 
  основанные на принципе проточной цитофлюорометрии
  
• 
  агглютинационные методы
  
• 
  с использованием капиллярого потока (иммунохроматографические)
  

Наиболее современные тест-системы для экспресс-диагностики основаны на принципе капиллярного потока (иммунохроматографические). При этом вирусные АГ конъюгируются с коллоидным золотом или селеном. Капля крови или другой жидкости наносится на абсорбирующую полоску, содержащую необходимые реагенты и конъюгаты. В результате капиллярного потока образца при наличии противовирусных АТ в крови или другой исследуемой жидкости на тестовой полоске возникает цветная реакция. При положительном результате правильность проведения теста подтверждает появление контрольной полоски. При отрицательном результате правильно проведенного теста появляется только контрольная полоска.

Исследование слюны на наличие АТ к ВИЧ

При необходимости обследования значительного контингента населения на наличие в слюне АТ к ВИЧ (чаще эпиднадзор для суждения о распространенности ВИЧ в конкретном регионе) используется экспресс-тест, основанный на принципе ИФА. К часто используемым тест-системам относятся Oral Specimen Collection Device (SmithKline Beecham), Omni-SAL (Saliva Diagnostic Systems), GAC ELISA (IgG antibody capture ELISA) и др. Чувствительность и специфичность тестов – около 99%. На втором этапе положительные результаты этих тестов подтверждаются ИБ.

Иммуноблот

Окончательный диагноз ВИЧ-инфекции устанавливается при положительных результатах ИБ (рис. 2). При проведении этого метода используется нитроцеллюлозная полоска с нанесенными на нее вирусными белками. После инкубации сыворотки определение наличия АТ к некоторым белкам ВИЧ проводится с использованием иммуноферментного метода. В соответствии с критериями American CDC результат ИБ считается положительным при наличии двух из трех полосок: gp41, p24, gp120/gp160; American FDA – трех полосок: р24, р31 и одной из двух – gр41 или gр120/gр160 .



Рис. 2 - Результаты иммуноблотинга ВИЧ

---

На сегодняшний день рекомендована следующая оценка результатов ИБ:

·        положительный результат – определение в сыворотке крови АТ к двум вирусным белкам из группы env при наличии или отсутствии белков – продуцентов gag и pol;

·        отрицательный результат - отсутствие АТ;

·        неопределенный результат - выявление в сыворотке крови АТ к белкам из групп gag и pol.

Неопределенный результат ИБ чаще обусловлен белками- продуцентами экспрессии гена gag ВИЧ-1 р15/р17, р24 и р55; в этих случаях возможен положительный или ложноположительный результат. Окончательный диагноз устанавливается при использовании высокочувствительных методов, в частности ПЦР. Также рекомендуется повторить ИБ через 1 мес. Альтернативным вариантом является использование тест-систем ИФА-ВИЧ-АТ/АГ с определением, кроме суммарных АТ к ВИЧ, р24-АГ.

При использовании ИБ могут наблюдаться ложноположительные результаты при некоторых заболеваниях и состояниях: поликлональной гаммаглобулинопатии, системных заболеваниях соединительной ткани, гипербилирубинемии, перекрестной реакции с другими вирусными АГ. Определение АГ р24 с использованием тест-систем ИФА

Ранняя диагностика ВИЧ-инфекции

Проблема ранней диагностики ВИЧ-инфекции может быть решена с помощью использования двух методик – реакции ПЦР для обнаружения РНК и высокочувствительного теста для выявления р24-АГ ВИЧ-1. После инфицирования ВИЧ-маркеры, идентифицирующие инфекцию, появляются в сыворотке в следующем порядке: вирусная РНК, р24-АГ и АТ к вирусным белкам. Считается, что использование ПЦР для выявления вирусной РНК является «золотым стандартом», позволяющим обнаружить инфекцию в наиболее ранние сроки. Ограничение применения методики связано с необходимостью предварительной обработки плазмы.

При определении р24-АГ методом ИФА плазма или сыворотка крови используются без предварительной обработки. Преимуществом также является стабильность р24 по сравнению с РНК ВИЧ. Коммерческие тесты для определения р24 в основном имеют чувствительность 3–9 пг/мл. Такие тест-системы сокращают интервал серонегативного «окна» по сравнению с тестами IV поколения ИФА со средней чувствительностью 25–50 пг/мл. Созданы еще более чувствительные иммуноферментные тест-системы для выявления р24-АГ ВИЧ-1, в частности «ДС–ИФА–ВИЧ–АГ-Скрин, РФ» с чувствительностью 0,5 пг/мл. Эта тест-система позволяет значительно сократить фазу серонегативного «окна» по сравнению с тестами с более низким порогом чувствительности.

---

 Основной белок сердцевины ВИЧ (р24) может использоваться как дополнительный маркер в диагностике ранней фазы ВИЧ-инфекции, когда АТ отсутствуют или их концентрация настолько низкая, что даже очень чувствительные тест-системы ИФА не могут их выявить. Определение р24-АГ также помогает в установлении наличия ВИЧ- инфекции в более поздних ее стадиях, когда на фоне иммунодепрессии снижается синтез АТ к вирусу и их титр находится в концентрациях ниже разрешающей способности тест-систем ИФА. Определение р24-АГ наиболее целесообразно в ранней стадии ВИЧ-инфекции и в более поздних стадиях при    отсутствии АТ по результатам ИФА и при наличии оснований предполагать ВИЧ-инфекцию. В иммуноферментных тест-системах для выявления р24-АГ с чувствительностью 0,5 пг/мл используется одностадийный сэндвич-вариант постановки с поэтапным внесением конъюгатов. При этом достигается высокий уровень чувствительности анализа за счет процесса амплификации сигнала при взаимодействии биотина со стрептавидин- пероксидазой. Тест-системы для определения р24 с чувствительностью 0,5 пг/мл способны выявлять АГ в тот же период времени после заражения, что и вирусную РНК методом ПЦР, и на 2–7 дней раньше, чем тест-системы для определения р24 с более низкой чувствительностью. 

Идентификация р24 подтверждает наличие ранней стадии ВИЧ-инфекции, служит ее дополнительным маркером и показателем активации репликации вируса, позволяет повысить контроль при заготовке крови и ее препаратов. Эффективность выявления ранней ВИЧ-инфекции с использованием иммуноферментных тест-систем для обнаружения р24-АГ ВИЧ-1 с чувствительностью 0,5 пг/мл значительно выше, чем тест-систем с более низкой чувствительностью, выявляющих р24, и сравнима с тестами, определяющими вирусную РНК методом ПЦР. Важным преимуществом является непродолжительное время анализа. Так, при использовании тест- системы «ДС–ИФА–ВИЧ–АГ-Скрин» оно составляет 1 ч. 55 мин. Иммуноферментные тест-системы для определения АГ р24 с чувствительностью 0,5 пг/мл могут быть эффективно использованы для проведения скрининга донорской крови, обследования лиц из группы риска для ранней диагностики ВИЧ-инфекции.

Тест-система для выявления антител к антигенам ВИЧ методом иммуноблотинга.

Полимеразная цепная реакция в диагностике ВИЧ- инфекции

ПЦР можно регистрировать по завершении амплификации (по конечной точке) либо на протяжении всей реакции (в реальном времени). В «классической» ПЦР анализ результатов проводится по конечной точке. С этой целью используется несколько методов: электрофорез в геле, гибридизационно-ферментный анализ (ГиФА), флуоресцентная детекция после ПЦР(FLASH) и др. Эти методы определяют количество продукта по завершении процесса, статически характеризуя динамический процесс. Методы ГиФА и FLASH более специфичны по сравнению с электрофорезом ДНК в результате повышения специфичности пробы к целевому амплификату. Преимуществом ПЦР в реальном времени является оценка исходного количества копий ДНК в образце.

---

Таким образом, для выявления ВИЧ-инфекции используют три теста:

• 
  ИФА-скрининг – тест имеет высокую чувствительность, хотя менее специфичен, чем ИБ;
  
• 
  vestern-blot, или ИБ, - позволяет установить наличие ВИЧ-инфекции;
  
• 
  определение р24-АГ - выявляется на протяжении примерно 2 недель ранней стадии ВИЧ-инфекции.
  

Стадии лабораторной классификации ВИЧ

Острая, ранняя и текущая ВИЧ-инфекция как стадии лабораторной классификации

Определение срока инфицирования ВИЧ прежде всего необходимо для проведения эпидемиологического мониторинга. Появляется возможность оценить два важных показателя – распространенность (prevalence) ВИЧ- инфекции и частоту новых случаев (incidence), необходимых для оценки течения эпидемии. С учетом устойчивого сочетания лабораторных критериев выделяют:

• 
  острую(acute) инфекцию - соответствует клинической стадии инкубации;
  
• 
  раннюю(recent) инфекцию - соответствует клинической стадии первичных проявлений;
  
• 
  текущую(established) инфекцию - все остальные клинические стадии за исключением последних стадий СПИДа;
  
• 
  серореверсию (снижение уровня титра антител к ВИЧ на фоне выраженной иммунодепрессии в поздних стадиях СПИДа, когда чувствительность тест- систем ИФА не позволяет установить низкий титр АТ к ВИЧ).
  

Определение острой ВИЧ-инфекции важно для контроля безопасности трансфузии донорской крови и ее препаратов. Динамика маркеров в период ранней ВИЧ-инфекции представлена на рис. 3. При острой инфекции ДНК ВИЧ-1 в клетках крови определяется на 5–6-й день заражения и в течение всего инфекционного процесса. РНК ВИЧ-1 (в высоких титрах) в сыворотке крови выявляется на 5–6-й день инфицирования и до сероконверсии (продолжительность периода определения – около 3–4 нед). Репликация ВИЧ уменьшается ниже уровня определения методом ПЦР в результате пока еще эффективного Т-клеточного иммунного ответа. При острой инфекции р24-АГ начинает выявляться в плазме крови с 11–16-го дня после заражения и может быть обнаружен в течение примерно 2 нед. Таким образом, р24-АГ определяется позже РНК ВИЧ, и продолжительность его выявления - меньше.

Через 3–4 нед. после инфицирования активируется гуморальный иммунный ответ. В крови появляются АТ к АГ ВИЧ – р24, gp41 и gp120, наблюдается сероконверсия, она может сохраняться до 3 мес. Сероконверсия совпадает с окончанием острой инфекции. В дальнейшем происходит снижение эффективности Т-клеточного ответа, прогрессирующее до выраженной иммунодепрессии в поздних стадиях СПИДа. Когда ВИЧ- инфекция находится в острой стадии (до появления АТ к АГ вируса), ИФА дает отрицательный результат в определении АТ. С целью более раннего подтверждения наличия инфекции дополнительно могут использоваться тесты для определения р24-АГ и РНК ВИЧ. Вирусная нагрузка на самых ранних этапах ВИЧ-инфекции очень высока и составляет от 10

---

Смотрите также файлы

• П п Имя.docx

• .docx

• Понятие научной, религиозной, профессиональной этики.docx

• Правила не распространяются на проведение экскурсионных мероприятий и организованных походов.docx

• Вариант 1 Приведите основные физические свойства жидкости.docx