ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 16.04.2021
Просмотров: 1261
Скачиваний: 1
46
Рис
.6.
Х роматограмма
полуколичеств енного
опред еления
Ni
2+
метод ом
бумажной
осад очной
хроматографии
.
Рис
. 7.
К алибровочны й
график
опред еления
ионов
Ni
2+
метод ом
осад очной
бумажной
хроматографии
.
Ла б ора т орна я
ра б от а
№
3.
Ка ч е ст ве нное
оп ре де ле ни е
а ми ноки слот
в
б е лковом
ги дроли за т е
ме т одом
б ума ж ной
хрома т огра фи и
Ц е ль
ра бот ы
:
раз д еление
аминокислот
метод ом
бумажной
хроматографии
и
установление
качеств енного
состав а
белкового
гид ролиз ата
.
Сущ ност ь
ра бот ы
.
О тход ы
мя со
-
и
птицекомбинатов
,
сод ержащ ие
больш ое
количеств о
протеинов
и
белковы х
соед инений
,
под в ергаются
в озд ейств ию
перегретого
пара
в
ав токлав ах
.
П олученны й
гид ролиз ат
сод ержит
более
15
аминокислот
и
служит
э ффектив ной
кормовой
д обав кой
в
жив отновод ств е
.
П род олжительность
и
технические
параметры
гид ролиз а
(
д ав ление
,
температура
),
а
также
состав
,
норма
и
рацион
кормовы х
д обав ок
з ав ися т
от
аминокислотного
состав а
белкового
гид ролиз ата
.
У становление
качеств енного
состав а
белкового
гид ролиз ата
основано
на
раз личны х
скоростя х
перемещ ения
по
хроматографической
бумаге
компонентов
анализ ируемой
пробы
относительно
фронта
раств орителя
.
При боры
и
ре а кт и вы
:
1.
Х роматографическая
камера
2.
Х роматографическая
бумага
,
в атман
№
1.
3.
М икропипетка
емкостью
0,1
мл
.
4.
П ульв ериз атор
.
47
5.
П инцет
.
6.
Суш ильны й
ш каф
.
7.
Раств оритель
:
смесь
бутилового
спирта
с
уксусной
кислотой
и
д истиллированной
в од ой
в
объемном
соотнош ении
4:1:5.
8.
П рояв итель
: 200
мг
нингид рина
в
100
мл
ацетона
.
9.
А минокислоты
:
аланин
,
лиз ин
,
в алин
,
тирозин
,
аспарагиновая
и
глутаминовая
кислоты
–
станд артны е
раств оры
с
концентрацией
0,01
моль
/
л
.
10.
А нализ ируемы й
белковы й
гид ролиз ат
.
Вы полне ни е
ра бот ы
П од готовка
хроматографической
бумаги
.
В ы рез ают
полоски
хроматографической
бумаги
д линой
30
см
и
ш ириной
,
соотв етств ующ ей
ш ирине
хроматографической
камеры
.
Сниз у
на
расстоянии
4
см
каранд аш ом
провод я т
стартовую
линию
.
О тступив
от
края
линии
на
2
см
,
отмечают
перв ую
точку
.
Станд артны е
раств оры
аминокислот
и
анализ ируемы й
белковы й
гид ролиз ат
нанося т
на
линию
старта
на
расстоянии
2-3
см
д руг
от
д руга
.
Х роматографирование
.
П робы
объемом
0,01
мл
нанося т
микропипеткой
путем
прикосновения
к
бумаге
в
д в а
приема
по
0,005
мл
в
од ну
и
ту
же
точку
.
Д иаметр
капли
на
бумаге
не
д олжен
прев ы ш ать
3
мм
.
Х роматограммы
под суш ив ают
в
суш ильном
ш кафу
и
помещ ают
в
хроматографическую
камеру
с
раств орителем
.
П ри
э том
нижний
край
хроматограмм
погружают
в
раств оритель
на
1-1,5
см
.
Раств оритель
пропускают
через
бумагу
в
течение
3
ч
.
Д ля
раз д еления
аминокислот
необход имо
3-
кратное
пропускание
раств орителя
с
период ическим
в ы суш ив анием
хроматограмм
.
Затем
хроматограммы
из в лекают
из
камеры
,
отмечают
фронт
д в ижения
раств орителя
и
помещ ают
в
суш ильны й
ш каф
(70
о
С
)
на
10-15
мин
.
Х роматограммы
прояв ля ют
раств ором
нингид рина
в
ацетоне
(
опры скив ают
из
пульв ериз атора
),
нижний
край
хроматограмм
под д ержив ают
пинцетом
,
чтобы
лист
бумаги
располагался
в ертикально
.
П осле
э того
хроматограммы
под суш ив ают
в
суш ильном
ш кафу
при
70
о
С
в
течение
15
мин
.
П ри
прояв лении
хроматограмм
поя в ля ются
пя тна
сиренев о
-
фиолетового
цв ета
на
некотором
расстоянии
д руг
от
д руга
.
К ачеств енны й
анализ
аминокислот
провод я т
путем
сопостав ления
положения
пя тен
станд артны х
раств оров
аминокислот
и
анализ ируемого
гид ролиз ата
.
Д ля
э того
рассчиты в ают
в еличину
R
f
д ля
кажд ой
аминокислоты
как
отнош ение
пути
,
пройд енного
аминокислотой
(
расстояние
от
линии
старта
д о
центра
пя тна
),
к
пути
,
пройд енному
раств орителем
(
расстояние
от
линии
старта
д о
границы
смещ ения
раств орителя
).
К ажд ая
аминокислота
при
од инаковы х
условия х
э ксперимента
имеет
постоянную
в еличину
R
f
.
Срав нение
э тих
в еличин
,
характериз ующ их
смещ ение
з он
аминокислот
станд артны х
раств оров
и
48
полученны е
при
хроматографировании
белков ого
гид ролиз ата
,
позв оля ет
сд елать
в ы в од
о
качеств енном
состав е
гид ролиз ата
.
Рис
.
Х роматограмма
качеств енного
опред еления
аминокислот
метод ом
бумажной
хроматографии
.
Ла б ора т орна я
ра б от а
№
4.
Коли ч е ст ве нное
оп ре де ле ни е
а сп а ра ги новой
,
глут а ми новой
ки слот
и
ва ли на
в
б е лковом
ги дроли за т е
ме т одом
б ума ж ной
хрома т огра фи и
Ц е ль
ра бот ы
:
раз д еление
и
количеств енное
опред еление
аминокислот
в
белковом
гид ролиз ате
метод ом
нисход я щ ей
хроматографии
на
бумаге
.
Сущ ност ь
ра бот ы
.
П ри
получении
аминокислот
необход им
постоянны й
и
над ежны й
контроль
з а
состав ом
белковы х
гид ролиз атов
.
А нализ
основан
на
раз д елении
компонентов
в след ств ие
их
раз личны х
скоростей
перемещ ения
по
хроматографической
бумаге
.
К оличеств енно
аминокислот
опред еля ют
фотометрически
после
перев ед ения
компонентов
в
э танольны й
раств ор
.
В
качеств е
фотометрического
реактив а
применя ют
сульфат
мед и
(II).
При боры
и
ре а кт и вы
:
1.
Х роматографическая
камера
.
2.
Х роматографическая
бумага
,
в атман
№
2.
3.
П ульв ериз атор
.
4.
М икропипетка
емкостью
0,1
мл
.
5.
П робирки
емкостью
30
мл
.
6.
Ф отоэлектроколориметр
7.
К юв еты
с
толщ иной
поглощ ающ его
слоя
1
см
.
8.
А налитические
в есы
.
9.
Суш ильны й
ш каф
.
10.
Э тиловы й
спирт
, 96 %-
ны й
раств ор
.
49
11.
8-
гид роксихинолин
: 0,1
г
препарата
раств оря ют
в
100
мл
смеси
бутилов ого
спирта
с
уксусной
кислотой
и
в од ой
(4:1:2).
12.
Раств оритель
:
смесь
бутилового
спирта
с
уксусной
кислотой
и
в од ой
в
объемном
соотнош ении
4:1:5.
13.
П рояв итель
: 200
мг
нингид рина
раств оря ют
в
100
мл
ацетона
.
14.
Э люент
: 10
мл
раств ора
сульфата
мед и
с
массовой
д олей
0,005 %
в
э тиловом
спирте
раз бав ля ют
90
мл
э тилового
спирта
,
получают
раств ор
сульфата
мед и
с
массовой
д олей
5
⋅
10
-4
%.
15.
А минокислоты
:
аспарагиновая
,
глутаминовая
,
в алин
–
станд артны е
в од ны е
раств оры
с
концентрацией
0,01
моль
/
л
.
16.
А нализ ируемы й
белковы й
гид ролиз ат
.
Вы полне ни е
ра бот ы
П од готовка
хроматографической
бумаги
.
Д ля
раз д еления
аминокислот
применя ют
бумагу
,
пред в арительно
обработанную
раств ором
8-
гид роксихинолина
(
при
э том
уд аля ются
след овы е
количеств а
катионов
металлов
).
Л исты
бумаги
,
соотв етств ующ ие
по
раз меру
хроматографической
камере
,
помещ ают
в
раств ор
8-
гид роксихинолина
.
Через
1-2
мин
бумагу
под суш ив ают
в
суш ильном
ш кафу
при
105
о
С
(
работают
в
в ы тя жном
ш кафу
!),
помещ ают
в
хроматографическую
камеру
,
з акрепля ют
од ин
конец
в
кюв ете
с
под в ижны м
раств орителем
(
э люентом
).
Раств оритель
пропускают
по
бумаге
св ерху
в низ
д о
полного
уд аления
темноокраш енны х
гид роксихиноля тов
в
течение
36-48
ч
.
П ромы тую
бумагу
суш ат
в
в ы тя жном
ш кафу
.
П остроение
град уировочного
графика
.
Готовя т
в од ны е
раств оры
аминокислот
с
концентрацией
0,01
моль
/
л
.
Н ав ески
аминокислот
,
соотв етств ующ ие
10
мл
раств ора
э той
концентрации
,
состав ля ют
д ля
аспарагиновой
кислоты
13,3,
в алина
11,7,
глутаминовой
кислоты
14,7
мг
.
М икропипеткой
нанося т
на
бумагу
(5, 10, 15, 20)
⋅
10
-3
мл
станд артны х
раств оров
аминокислот
порция ми
объемом
по
5
⋅
10
-3
мл
на
расстоянии
5
см
от
края
с
таким
расчетом
,
чтобы
кажд ая
точки
град уировочного
графика
соотв етств овала
0,05; 0,10; 0,15
и
0,20
мг
аминокислоты
.
Раств ор
нанося т
на
бумагу
только
после
в ы суш ив ания
пред ы д ущ их
капель
.
О птимальной
д ля
в ы полнения
работы
я в ля ется
сред а
с
рН
5-6,
при
э том
устраня ется
иониз ация
аминокислот
.
Х роматографирование
.
Раз д еление
аминокислот
провод я т
нисход я щ им
метод ом
.
К онец
бумаги
,
на
котором
нанесены
капли
раств оров
,
помещ ают
в
кюв ету
с
под в ижны м
раств орителем
так
,
чтобы
пя тна
исслед уемы х
раств оров
не
погружались
в
раств оритель
.
В
качеств е
под в ижного
раств орителя
применя ют
в ерхний
слой
смеси
бутилового
спирта
с
уксусной
кислотой
и
в од ой
.
Н ижний
слой
смеси
пред наз начен
д ля
насы щ ения
камеры
.
Д ля
раз в ития
хроматограммы
раств оритель
пропускают
на
2/3
д лины
бумаги
,
з атем
хроматограмму
в ы суш ив ают
и
в торично
пропускают
через
нее
50
под в ижны й
раств оритель
.
Т аким
образ ом
,
хроматог
рамму
обрабаты в ают
3
раз а
.
Затем
полоску
бумаги
в ы суш ив ают
и
прояв ля ют
хроматограмму
раств ором
нингид рина
(
опры скив ают
из
пульв ериз атора
).
П рояв ленную
хроматограмму
нагрев ают
15-20
мин
при
60
о
С
в
суш ильном
ш кафу
.
Расположение
з он
аминокислот
по
направ лению
д в ижения
раств орителя
(
св ерху
в низ
)
след ующ ее
:
аспарагиновая
кислота
,
глутаминовая
кислота
,
в алин
.
П осле
раз в ития
хроматограммы
в ы рез ают
участки
пя тен
,
з анимаемы е
аминокислотами
,
сбоку
хроматограммы
в ы рез ают
контрольны е
участки
,
не
сод ержащ ие
аминокислот
и
рав ны е
по
площ ад и
з онам
опред еля емы х
соед инений
.
В ы рез анны е
участки
бумаги
из мельчают
ножницами
и
помещ ают
в
пробирки
.
В
кажд ую
пробирку
д обав ля ют
по
10
мл
э люента
,
объем
д овод я т
д о
20
мл
э тиловы м
спиртом
и
в стря хив ают
.
Э люирование
происход ит
в
рез ультате
образования
комплексного
соед инения
аминокислот
с
Cu(II)
оранжев ого
цв ета
,
раств оримого
в
э тиловом
спирте
.
П робирки
с
э люатами
помещ ают
в
з атемненное
место
и
остав ля ют
на
1
ч
.,
период ически
перемеш ив ают
их
сод ержимое
.
К оличеств енны й
анализ
.
О птическую
плотность
э кстрактов
из меря ют
на
фотоэлектроколориметре
при
λ
=530
нм
.
К онтрольны й
раств ор
сод ержит
в се
необход имы е
реактив ы
,
кроме
аминокислот
.
Строят
град уировочны й
график
в
коорд инатах
оптическая
плотность
–
концентрация
аминокислот
,
моль
/
л
.
П о
графику
наход я т
концентрацию
аминокислот
в
анализ ируемом
белковом
гид ролиз ате
.
Х РО М АТО ГРАФ И ЧЕС КИ Е
М ЕТО ДЫ
АНА ЛИ ЗА
В
Ф АРМ АЦ И И
И
Х И М И КО
-
Ф АРМ А Ц ЕВТИ ЧЕС КО Й
ПРО М Ы Ш ЛЕННО С ТИ
Ф армация
относится
к
числу
наиболее
д рев них
естеств енны х
наук
,
объектами
исслед ования
которой
уже
в
д алекие
в ремена
бы ли
в
больш инств е
случаев
объекты
растительного
или
жив отного
происхожд ения
.
Э ти
природ ны е
объекты
или
прод укты
их
простейш ей
переработки
–
отв ары
,
э кстракты
и
т
.
п
.
–
отличаются
больш ой
сложностью
состав а
,
поскольку
в ключают
пред став ителей
самы х
раз нообраз ны х
классов
органических
соед инений
.
О бнаружение
,
а
тем
более
количеств енное
опред еление
в
э тих
сложны х
объектах
физ иологически
актив ны х
в ещ еств
я в ля лось
перв оочеред ной
з ад ачей
фармации
,
од нако
реш алась
она
из
-
з а
несоверш енств а
и
труд оемкости
сущ еств овав ш их
д о
в торой
половины
Х Х
в
.
метод ов
раз д еления
крайне
мед ленно
.
Реш ение
проблемы
в ы д еления
инд ив ид уальны х
природ ны х
соед инений
в
качеств е
лекарств енны х
в ещ еств
из
природ ны х
источников
сы рья
и
проблемы
контроля
чистоты
появ ив ш ихся
в
конце
Х
IX
–
начале
XX
в
.
синтетических
лекарств енны х
препаратов
также
сущ еств енно
сд ержив алось
отсутств ием
унив ерсальны х
метод ов
раз д еления
сложны х
смесей
органических
соед инений
.