Файл: 1. Иммобилизованные ферменты и их преимущества 5 Основы технологии иммобилизации ферментов 9.docx

2. Основы технологии иммобилизации ферментов

2.1. Общие принципы иммобилизации

Иммобилизацию можно рассматривать как физическое разделение биокатализатора (клеток, клеточных фракций или ферментов) и растворителя, при котором молекулы субстрата и продукта могут легко обмениваться между фазами. Разделение катализатора и растворителя может быть достигнуто либо адсорбционным, либо ковалентным связыванием с нерастворимым органическим или неорганическим носителем, либо связыванием отдельных молекул катализатора друг с другом с образованием агрегатов или сополимеров. Недостатком этих методов иммобилизации является необходимость использования большого количества катализаторов. Кроме того, химическая модификация, которой подвергаются препараты (ферменты, клетки) в процессе иммобилизации, может нежелательным образом изменить их каталитические и другие свойства. По этой причине многие исследователи предпочитают отделение клеток или ферментов от остального объема и включение в носитель или инкапсулирование. Таким образом катализатор можно включить в полимерную сетку, например, полиакриламидного геля или геля альгината кальция, путем проведения полимеризации или реакции полярного сшивания геля в присутствии ферментов или клеток [7, с. 76].

Родственными методами являются либо инкапсулирование в липосомы, нейлоновые или коллодиевые мембраны, либо их физическое отграничение от других компонентов в аппаратах для ультрафильтрации. Для облегчения работы с частицами, содержащими биокатализатор, им придают по возможности сферическую форму.

При одностадийной катализируемой реакции иммобилизуют или подходящий фермент, или жизнеспособные клетки, обладающие необходимой активностью. В первом случае, чтобы увеличить степень включения и свести к минимуму утечку фермента, требуется высокая степень сшивки носителя. Однако при высокой степени сшивки может ограничиться диффузия молекул субстрата и продукта внутрь частиц носителя и из них наружу. Эта проблема исчезает в случае иммобилизации клеток. Поскольку размеры клеток относительно велики, то можно использовать носители с низкой степенью сшивки и, следовательно, с хорошими диффузионными свойствами.

---

Для катализа многостадийных реакций, например превращение глюкозы в этанол, где регенерация и удержание кофакторов является обязательным условием, необходимо особое внимание уделять влиянию сшивающих агентов на жизнеспособность клеток. Нужно также иметь ввиду и подачу и отвод необходимого для данных клеток количества газов (кислорода, СО₂). Таким образом, включение живых клеток требует мягких условий иммобилизации; носитель при этом должен представлять систему открытых пор, обеспечивающих хорошие условия для газообмена. К сожалению, частицы носителя, полученные с учетом этих требований, обладают низкой прочностью. Этот фактор особенно важен при увеличении масштабов процесса.

Методы иммобилизации часто рассматриваются с точки зрения природных сил, удерживающих препарат в зоне носителя. В этом случае методы иммобилизации подразделяют на химические и физические. В первом случае препарат химически «пришивается» к носителю, что, в свою очередь, может осуществляться как на поверхности соответствующего нерастворимого материала, так и в объеме носителя. Во втором случае удержание препарата носителем осуществляется за счет физических факторов: адсорбционно, полупроницаемой мембраной, электрическим полем и т. д., в этом случае имеют ввиду иммобилизацию, при которой препарат не соединяется с носителем ковалентными связями.

Другой принцип классификации методов основывается на следующих положениях: производится ли иммобилизация одновременно с обездвиживанием препарата и образованием матрицы носителя или же процесс иммобилизации происходит на заранее приготовленной нерастворимой основе, на которой тем или иным способом закрепляют биологическое действующее начало.

В ряде случаев конкретный препарат (клетка) прикрепляется в реальных условиях к нерастворимым материалам (например, древесина, почва, минералы и др.). В этом случае жизнедеятельность клетки в иммобилизованном состоянии является для нее естественной, отличающейся от природной только искусственно поддерживаемыми в биотехнологическом процессе внешними параметрами (температура, давление, влажность и др.) и набором подаваемых клетке веществ.

---

Иммобилизация препаратов (т. е. удерживание на носителе) может быть как необратимой, так и временной. Когда иммобилизуют растущую, интенсивно делящуюся культуру, часто наблюдается постепенный переход из фазы носителя в окружающую среду, даже если исходная биомасса была фиксирована носителем необратимо. Но иногда оказывается удобной обратимая фиксация. В этом случае, возможно, удалить отработавшие свой срок клетки и вновь иммобилизовать свежие. Такой подход к регенерации биокатализаторов удается применять, например, в случае адсорбционных вариантов иммобилизации.

---

2.2. Методы физической иммобилизации

Все методы физической иммобилизации (т. е. иммобилизации, при которой фермент не соединен с носителем ковалентными связями) разделяют на четыре группы:

1. Адсорбция на нерастворимых носителях (т. е. на поверхности носителя).

2. Включение в поры геля.

3. Иммобилизация в полимерных пленках (мембранах).

4. Включение в двухфазную реакционную среду, где препарат может находиться только в одной из фаз.

Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из всех существующих способов. Еще в 1916 году Нельсон и Гриффин провели успешную иммобилизацию инвертазы путем адсорбции на активированном угле и геле гидроксида алюминия.

Адсорбционная иммобилизация клеток, в частности микроорганизмов основывается часто на способности многих из них прикрепляться к разнообразным твердым или гелеобразным носителям и продолжать жизнедеятельность в таком состоянии (микробные популяции почвы, кишечника, рубца, некоторые азотфиксирующие микроорганизмы растений и т. д.).

Поверхность клеток неоднородна, характеризуется мозаичной структурой — наличием гидрофильных и гидрофобных участков. Разнообразие свойств поверхности клеток и адсорбентов определяют различные механизмы адсорбционного взаимодействия (ион-ионные взаимодействия, ван-дер-ваальсовы силы и т. д.).

Однако указанные подходы к классификации способов иммобилизации оставляют в стороне проблему микроокружение препарата. Поэтому предлагается использовать следующую классификацию [10, с. 26]:

1. Иммобилизация на носителе или на поверхности носителя. В этом случае удерживающая поверхность или часть поверхности носителя «омывается» внешней средой (жидкой или газообразной).

2. Иммобилизация в носителе или в массе (объеме) носителя. Между внешней средой и препаратом в результате иммобилизации появляется слой материала носителя. В данном случае свойства носителя (например, пористость, заряд, гидрофильность) в значительной степени могут сказываться на функционировании иммобилизованного препарата и на уровне реализации потенциальных возможностей.

3. Иммобилизация с использованием мембранной технологии. Препарат и небольшая часть внешней среды помещены в замкнутый объем, отделенный от остальной среды избирательно проницаемой мембраной, размер пор, в которой таковы, что субстраты и продукты через них проникают, а иммобилизованный препарат удерживается внутри замкнутого объема.

---

Иммобилизация на поверхности носителя. Для осуществления данного подхода к созданию иммобилизованных систем используются разные носители: непористые, ячеистые и др.

При иммобилизации на носителе препарат может быть связан различными силами:

• 
  адсорбционно неспецифически — взаимодействие базируется на не ковалентных контактах (ионные, гидрофобные, водородные и др.);
  
• 
  адсорбционно биоспецифически — носитель, содержащий аффинные лиганды, способен образовать достаточно прочные комплексы с поверхностью препарата (в основе также лежат нековалентные взаимодействия);
  
• 
  химически удерживающая матрица должна иметь особые группировки, способные реагировать с компонентами препарата (этот случай можно рассматривать как хемосорбцию), либо для ковалентного связывания препарата с носителем необходим специальный сшивающий агент.
  

К достоинствам адсорбционной иммобилизации относятся исключительная простота методов ее проведения. По существу, иммобилизация происходит при контакте водной суспензии биопрепаратов с адсорбентом (исключение составляет иммобилизация с помощью электроадсорбции).

Способы адсорбционной иммобилизации разделяются на статические, с перемешиванием и путем нанесения на колонке (рисунок 1).


Рисунок 1 – Способы адсорбционной иммобилизации: а – статический;
б – с перемешиванием; в – нанесения в колонке
Статический способ наиболее прост и заключается в том, что носитель (адсорбент) вносят в суспензию биопрепарата и смесь некоторое время инкубируют. Иммобилизация достигается за счет осаждения клеток и последующей их адсорбции на частицах носителя. Недостатком способа является необходимость длительного контакта адсорбента с суспензией биопрепарата.

Способ с перемешиванием обеспечивает более быстрое завершение процесса адсорбции и более равномерное заполнение носителя.

Способ нанесения в колонке заключается в прокачивании суспензии с препаратом через колонку, заполненную носителем.

Иногда для проведения адсорбционной иммобилизации применяют метод электроосаждения (электроадсорбция) (рисунок 2). В этом случае в раствор препарата погружают два электрода

---