Файл: 1. Иммобилизованные ферменты и их преимущества 5 Основы технологии иммобилизации ферментов 9.docx

Образование связи между полимером (целлюлоза), обработанным металлом, и ферментом (с появлением ферментативно активного производного) будет успешным лишь при выполнении следующих условий:

• 
  в молекуле фермента должны присутствовать группы, способные выступать в роли лигандов;
  
• 
  контакт этих групп с атомами металла стерически возможен;
  
• 
  эти группы не должны находиться в области активного центра фермента;
  
• 
  молекулы фермента, уже связанные с носителем, не должны располагаться слишком близко друг к другу.
  

Удельная активность получаемых препаратов на основе различных ферментов (глюкоамилаза, инвертаза, нуклеаза и др.) обычно довольно высокая (50–80 %). В результате иммобилизации металлохелатным методом константа Михаэлиса фермента, как правило не меняется.

Использование хлорида титана приводило к получению препарата иммобилизованного фермента с большей активностью, чем в его отсутствии. Метод весьма прост и состоит из следующих стадий:

1. Взвесить в чашке 10 г микрокристаллической целлюлозы.

2. Добавить 50 мл 15 %-го (вес/объем) хлорида титана (IV) к 15 %-ной (вес/объем) HCl и хорошо перемешать.

3. Поместить смесь в вакуумный эксикатор с гидроксидом натрия и откачать воздух.

4. Выдержать смесь в сушильном шкафу при 45 ºС до полного высыхания (примерно 24 ч).

5. Промыть сухой остаток три раза буферным раствором (рН буфера обычно выбирают соответствующим оптимальной активности фермента), пока носитель не станет практически белым.

6. К промытому носителю добавить раствор фермента, содержащий 1 г белка, и перемешивать при 4 ºС в течение 18 ч.

7. Отцентрифугировать суспензию и промыть иммобилизованный фермент буфером, затем буфером, содержащим 1 М NaCl, еще раз этими же растворами, затем еще два раза буфером.

8. Ресуспендировать иммобилизованный фермент в буфере и хранить при 4 ºС.

Потенциальная возможность использования ферментного препарата в промышленных целях связана с его стабильностью в процессе функционирования (операционная стабильность). В этом плане металлохелатная иммобилизация дает неоднозначные результаты, которые зависят от вида фермента, материала носителя, условий окружающей среды и т. д. Особенно низкая операционная стабильность наблюдается при использовании высокополимерных субстратов.

---

Логическим развитием рассматриваемого метода явилось его использование для иммобилизации целых клеток, в частности микроорганизмов.

Процесс иммобилизации на гидроксидах металлов представляет собой замещение гидроксильных групп на поверхности гидроксида подходящими лигандами, входящими в состав фермента или клетки. В результате образуются связи, аналогичные ковалентным. Структурная сложность клеточных оболочек обеспечивает достаточное разнообразие подходящих лигандов, входящих в состав белковых и углеводных компонентов клеточной стенки. В качестве примера применение иммобилизованных металлохелатным методом живых клеток, может служить сообщение об использовании таких клеток для производства уксуса.

Следует отметить, что рассмотренные методы иммобилизации для разных вариантов разработаны с различной степенью детализации. Выбор средств и путей реализации зависит от конкретных биотехнологических задач.

---

3. Носители для иммобилизованных ферментов

Для получения иммобилизованных ферментов и клеток используется огромное число носителей. Основные требования, предъявляемые к материалам, которые могут быть применены в качестве носителя для иммобилизации:

• 
  высокая механическая, химическая и биологическая устойчивость (стойкость), обеспечивающая стабильность получаемых иммобилизованных препаратов;
  
• 
  возможность получения технологически удобных форм (гранул, мембран, листов и т. д.);
  
• 
  носитель не должен затрагивать активность фермента или ферментативные системы клетки при реализации конкретной технологии, необходимо исключить нежелательные воздействия носителя (токсичность, температура, стресс и т. д.);
  
• 
  надежное удержание фермента и клетки носителем;
  
• 
  материал носителя не должен препятствовать обеспечению иммобилизованного препарата субстратами, газообмену и отводу продуктов жизнедеятельности;
  
• 
  высокая гидрофильность, обеспечивающая возможность реакций в водной среде;
  
• 
  дешевизна носителя и простота иммобилизации, т. е. экономическая оправданность.
  

Выполнить все требования крайне сложно, поэтому необходимо находить компромисс между «идеальным» и «реально возможным». Для приближения к оптимальному варианту необходима разработка научно-обоснованных подходов для выбора путей иммобилизации. Выбор путей иммобилизации и материала носителя на эмпирической основе — это надежда на случайную удачу, требующую больших затрат труда, времени и веществ. Поэтому необходимо в этом направлении проведение фундаментальных исследований.

Отсутствие носителей, удовлетворяющих одновременно всем требованиям, и разнообразие задач, стоящих перед экспериментаторами, обуславливают широкий набор применяемых для иммобилизации материалов. Для иммобилизации используются как органические, так и неорганические материалы.

Существующие в настоящее время органические полимерные носители можно разделить на два класса: природные полимеры и синтетические полимерные носители. В свою очередь класс природных полимеров можно подразделить на группы в соответствии с их биохимической классификацией: полисахаридные, белковые и липидные. Синтетические полимеры также могут быть подразделены на группы, например, в соответствии с химическим строением основной цепи макромолекул: полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные носители.

Природные носители. Большое значение природных полимеров в качестве носителей для иммобилизации объясняется их доступностью и наличием реакционноспособных функциональных групп (в исходном или модифицированном препарате), легко вступающих в различные химические реакции, а также высокой гидрофильностью. К недостаткам можно отнести неустойчивость к воздействию микроорганизмов, относительно высокую стоимость многих из них.

Полисахариды. Наиболее часто для иммобилизации используют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные [4, с. 87].

Целлюлоза представляет собой поли-1,4-β-D-глюкопиранозил-Dглюкопиранозу:



Целлюлоза отличается высокой степенью гидрофильности, а наличие большого количества гидроксильных групп дает возможность ее легко модифицировать путем введения различных заместителей.

Препараты целлюлозы для придания им химической устойчивости «сшивают» эпихлоргидрином. Для увеличения механической прочности целлюлозу гранулируют путем частичного гидролиза, в результате которого разрушаются ее аморфные участки. На их место для сохранения прочности между кристаллическими участками вводят химические сшивки. Гранулированная целлюлоза благодаря простоте получения, сравнительно низкой стоимости относится к удобным носителям для иммобилизации ферментов. К недостаткам целлюлозы как носителя можно отнести ее неустойчивость к воздействию сильных кислот, щелочей и окислителей.

Гранулированную целлюлозу довольно легко превращают в различные ионообменные производные, которые имеют промышленное значение.

К природным аминополисахаридам относится хитин. Его можно рассматривать как целлюлозу, в которой СН₂ОН-группа заменена ацетамидным остатком:



Хитин — основной компонент наружного скелета ракообразных, насекомых, а также клеточных оболочек некоторых грибов. Это соединение является отходом промышленной переработки креветок и крабов, поэтому доступно в больших количествах при относительно низкой стоимости.

Хитин обладает пористой структурой, не растворяется в воде, разбавленных кислотах и щелочах, а также в органических растворителях. Для переведения в реакционноспособную форму он может быть модифицирован глутаровым альдегидом, а также солями тяжелых металлов.

Обработка хитина концентрированными растворами щелочей (деацилирование) приводит к образованию хитозана. Хитозан имеет свободные аминогруппы, поэтому может использоваться для ковалентной иммобилизации с помощью бифункциональных реагентов: диальдегиды, диизоцианаты. В отличие от хитина хитозан растворяется в минеральных и органических кислотах, поэтому для иммобилизации он часто применяется в виде растворов (рН 3–7).

Полученные препараты иммобилизованных ферментов и других биобъектов на основе хитозана обладают высокой каталитической активностью и устойчивостью к микробному воздействию; наблюдается и повышение термостабильности белков, иммобилизованных на хитозане.

Декстран — поли-1,6-α-D-глюкопиранозил-D-глюкопираноза — разветвленный полисахарид из бактериальных источников, содержащий остатки глюкозы, связанные, в основном, 1,6-глюкозидными связями (а также 1,2-, 1,3- и 1,4- связями):



Фирмы «Pharmacia» и «Renal» выпускают ряд производных декстрана, содержащих различные функциональные группы (карбоксиметилсефадекс, сульфопропилсефадекс, диэтиламиноэтилсефадекс, диэтил-(2-оксипропил)-аминоэтилсефадекс, молселект).

Гели на основе декстрана обладают высокой стойкостью и гидрофильностью (из-за наличия большого количества гидроксильных групп).

К группе декстранов можно отнести и крахмал, представляющий смесь полисахаридов, основными компонентами которой являются амилоза — поли-1,4-α-D-глюкопиранозил-D-глюкопираноза и амилопектин — разветвленный полисахарид, состоящий из остатков D-глюкозы, связанной 1,4-α-глюкозидными связями, а в местах разветвлений – 1,6-α- глюкозидными связями.

При химической модификации крахмала сшивающими агентами (формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) получен новый носитель — губчатый крахмал. Этот носитель обладает повышенной устойчивостью по отношению к ферментам, гидролизующим полисахариды. Введение диэтанол- и триэтаноламинных групп дает возможность применять губчатый крахмал для иммобилизации.

Агароза — поли-β-галактопиранозил-3,6-ангидро-α-L-галактопираноза:



Агароза широко используется как носитель для иммобилизации. Однако стоимость ее очень высока, поэтому разрабатываются различные методы ее модификации с целью получения легко регенерируемых форм. При охлаждении горячего 2–6 % водного раствора агарозы до температуры ниже 45 ºС образуются прочные крупнопористые гели, представляющие собой сложную смесь из заряженных и нейтральных полисахаридов. Гели на основе агарозы выпускаются под названиями «сефароза» и «биогель А».

Агар выделяют из некоторых красных водорослей. Установлено, что он содержит, по крайней мере, два полисахарида: агарозу и агаропектин. Гели агара образуются аналогично агарозным при охлаждении до температуры ниже 38 ºС. После высушивания гель агара превращается в прозрачную пленку, что позволяет использовать для изучения иммобилизованных в геле препаратов оптические методы. К преимуществам агара следует отнести его низкую стоимость, нетоксичность и способность формировать механически прочные гели даже при малых концентрациях в растворе.

Улучшить свойства агара можно сшиванием эпихлоргидрином, диэпоксидными агентами и т. д. Сшитый агар с регулируемой проницаемостью устойчив к нагреванию даже в щелочной среде, обладает высокой механической прочностью, а наличие большого количества оксигрупп позволяет легко модифицировать носитель. Это дало основание отдельным исследователям считать агар почти идеальным носителем.

Альгиновые кислоты и их соли — это полисахариды бурых морских водорослей, состоящие из связанных β-1,4-связями остатков D-маннуроновой кислоты.



Они служат основой при получении альгинатных гелей. В присутствии моновалентных катионов эти полисахариды даже в низких концентрациях образуют вязкий раствор, а в присутствии двухвалентных катионов, особенно Ca²⁺, наблюдается образование геля. В зависимости от присутствующего катиона эти гели и носят различные названия: натрий альгинатный гель, кальций альгинатный гель и т. д.

Характерной особенностью этих носителей является зависимость их растворимости от температуры и рН-раствора. Для иммобилизации биопрепаратов широкое распространение получила система с альгинатом кальция. Выбор этого геля для иммобилизации произошел не случайно: условия включения в гель альгината кальция очень мягкие, полимер можно стерилизовать автоклавированием, и кроме того, процесс иммобилизации обратим, что достигается добавлением агента, связывающего Са²⁺ (например, ЭДТА или лимонной кислоты). Последнее особенно важно было на начальных этапах исследования, поскольку необходимо было изучать свойства клеток по мере их нахождения в иммобилизованном состоянии.

От соотношения концентрации альгината и Са²⁺ зависит плотность сшивки геля. Стабильность геля возрастает с увеличением концентрации полимера, но при высоких концентрациях альгината масса становится вязкой, что может затруднять процесс образования гранул. Поэтому необходимо подобрать такие условия, которые бы позволили получать стабильный гель.

Гепарин представляет собой кислый полисахарид, содержащий чередующие звенья сульфатированной D-глюкуроновой кислоты (или L-идуроновой) и сульфатированного глюкозамина (или N-ацетилглюкозамина):



Гепарин успешно применяется для получения водорастворимых препаратов иммобилизованных ферментов, используемых в медицине для введения in vivo.

к-Каррагинан. Каррагинаны представляют собой гетерогенные полисахариды, содержащие главным образом эфиры α-D-галактопиранозилсерной кислоты. к-Каррагинан — это нерастворимая фракция, которую получают при добавлении ионов Са²⁺ к водному экстракту каррагинана. При нагревании он растворятся, а при последующем охлаждении образует гель. Температура образования и качество геля зависят как от концентрации полимера, так и от количества присутствующих в растворе катионов (например, K⁺, NH₄⁺, Ca²⁺ или Ba²⁺).

Белки используют в качестве носителей для иммобилизации ферментов. Известно, что многие ферменты в клетке функционируют в тесном контакте с липидами и белками. Поэтому полагают, что изучение поведения ферментов, иммобилизованных на белковых матрицах, позволит также лучше понять закономерности функционирования ферментов in vivo. С точки зрения практической значимости важными свойствами этих носителей являются высокая вместимость по отношению к ферментам и способность к биодеградации, а также возможность применения большинства из них (благодаря фибриллярной природе) в виде тонкой пленки (толщина 80 мкм).

Иммобилизацию на белковых носителях можно проводить как в присутствии, так и отсутствии сшивающих агентов. К недостаткам белков как носителей, в частности для медицинских препаратов, используемых in vivo, следует отнести высокую иммуногенность (исключение составляют коллаген и фибрин).

Наиболее часто в качестве носителей применяют структурные белки, такие как кератин, фиброин, коллаген; двигательные белки, в частности миозин, а также транспортные белки, например сывороточный альбумин.

Коллаген — фибриллярный белок группы склеропротеидов, основной компонент хрящей и сухожилий, обладает высокой прочностью на разрыв. Особенностью этого белка является высокая гидрофильность. Легкость выделения коллагена и наличие большого числа групп для связывания ферментов делают возможным его использование в качестве носителя. Коллаген используют и в виде модифицированных производных. Например, блокированием амино- или карбоксильных групп изменяют поверхностный заряд носителя и, соответственно, гидрофильность, с помощью сшивающих аминов получают сжатую микроструктуру. Наиболее часто коллаген употребляется в азидной форме. В результате длительной обработки коллагена кипящей водой, в ходе чего гидролизуются некоторые его ковалентные связи, получают желатин. Ценностью этого носителя, обладающего гелевой структурой, является нетоксичность, легкость биодеградации, что позволяет применять его в фармацевтической и пищевой промышленностях.

Другим представителем фибриллярных белков группы склеропротеидов является кератин. Из кератина почти полностью состоят шерсть, волосы, роговые покровы, шелк и т. д. Чаще всего кератин получают при переработке перьев. Таким образом, кератин дешев и доступен в больших количествах.

Существуют две формы кератина — α и β. α-Кератин характеризуется высоким содержанием цистеина, что способствует иммобилизации препаратов, содержащих SH-группы. β-Кератины характеризуются высоким содержанием глицина и аланина, что способствует образованию вытянутой зигзагообразной полипептидной цепи. Нити β-кератина обладают мягкостью, гибкостью и нерастворимостью, однако по прочности уступают α-кератину.

При иммобилизации препаратов на носителях белковой природы необходимо учитывать диффузионные ограничения, определяемые гелевой структурой матрицы.

Липиды. Иммобилизация ферментов на природных липидных носителях (конструирование ансамблей белок—липид) может рассматриваться как приближение к живой клетке. Для такой иммобилизации, как правило, используются природные липиды — компоненты биомембран. Обычно липидные носители применяются в виде монослоев на различных поверхностях или бислоев (как правило, сферической формы). Липиды, имеющие хотя бы небольшую полярную «головку», способны образовывать мономолекулярную пленку на границе раздела фаз (вода—воздух, вода—неполярный растворитель). Липидные молекулы в монослое расположены таким образом, что полярные «головки» погружены в водную среду, а углеводные группы направлены в воздух или неполярную среду. Такая пленка способна сорбировать белковые молекулы.

Изучение монослоев липидов, содержащих белок, помогает также установить природу взаимодействия липидов и белков в биологической мембране.

Липидный монослой можно нанести на твердую подложку (силикагель, сажа и т. д.). В качестве липидной матрицы используют обычно лецитин, фосфатидилэтаноламин и холестерин. Возможность варьировать структуру и ориентацию молекул в липидных слоях достигается подбором полярности носителя и природы используемого растворителя липида. Если липид с молекулами бифильной природы, растворенный в неполярном органическом растворителе (бензол, гептан), адсорбировать на полярном силикагеле, то в монослое липида углеводородные цепи будут ориентированы наружу. При адсорбции липида из полярного растворителя на неполярной графитовой саже можно получить гидрофильный монослой, в котором полярные головки ориентированы в сторону растворителя.

В качестве природных носителей используются липосомы. Для приготовления липосом наиболее часто используются фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин и др. Размер и форма липосом зависит от способа их приготовления, а также от таких факторов, как кислотность среды, присутствие неорганических солей и природы используемого липида.

Существует три различных типа липосом: мультиламеллярные, моноламеллярные и макровезикулярные. Мультиламеллярные липосомы представляют собой замкнутые упорядочные структуры, состоящие из нескольких концентрических липидных бислоев, отделенных один от другого водной средой. Расстояние между соседними бислоями составляет 7,5 нм, диаметр центрального водного ядра равен 0,15 мкм, а общий диаметр мультиламеллярных липосом колеблется от 1–2 до 50 мкм.

Ультразвуковая обработка мультиламеллярных липосом приводит к трансформации их в моноламеллярные. Диаметр таких липосом составляет 20–50 нм.

Макровезикулярные липосомы образуются, например, путем слияния малых липосом, индуцируемого ионами Са²⁺, а также присутствием фосфолипидов с отрицательно заряженными головными группами. Такие липосомы состоят из одного бислоя и имеют диаметр от 60 нм до 100 мкм.

Широкое применение липосом как носителей для ферментов и лекарственных препаратов обусловлено простотой получения, легкостью регенерации иммобилизованного материала, а также возможностью использования in vivo благодаря близости свойств этих липидов — носителей и природных биомембран.

Синтетические полимерные носители. Огромное разнообразие доступных синтетических полимеров обеспечило их широкое использование в качестве носителей для иммобилизации. Вводя в полимерные молекулы различные функциональные группы, можно в широких пределах варьировать физические свойства носителей и создаваемое ими микроокружение для иммобилизованных препаратов.

Синтетические полимеры применяются как для ковалентной иммобилизации, так и сорбционной, а также для получения гелей и микрокапсул.

Полимеры на основе стирола являются основой многих промышленных марок ионообменных материалов. Для сорбционной иммобилизации применяются как микропористые, так и макропористые (размер пор 10–1000 нм) материалы. Сополимеры стирола в виде сферических частиц с различными сшивающими агентами можно получить гранульной полимеризацией. Геометрическая структура таких макропористых носителей (размер пор, удельная поверхность) варьирует в широких пределах при изменении количества агента и концентрации растворителя мономеров в реакционной среде. Наиболее часто в качестве сшивающего агента используется дивинилбензол. Пористость сополимеров стирола регулируют полимеризацией в присутствии порообразователей, например добавок, разлагающихся при нагревании с выделением газообразных веществ (NH₄Cl).

В последние годы стали применяться носители, имеющие макросетчатую, изопористую и гетеропористую структуры. Макросетчатые полистиролы подобны стеклам. Они имеют стабильную структуру пор, не набухают в воде, отличаются повышенной механической прочностью. Получают их эмульсионной сополимеризацией стирола с дивинилбензолом в присутствии осаждающего вещества. Изопористый полистирол образуется при сшивании стирола в дихлорэтане, содержащем n-ксилилендихлорид. Под действием монохлордиметилового эфира и парообразователя получают гетеропористый полистирол с диаметром пор 1 мкм. Применение гетеропористых носителей обеспечивает высокую остаточную активность биопрепаратов.

---

Немодифицированные полистирольные носители гидрофобны. Присоединением ионогенных групп в пароположении бензольных радикалов можно придать некоторую гидрофильность, хотя в целом, сохраняется склонность полимера к гидрофобным взаимодействиям.

Широкие возможности для разработки новых видов носителей открывает введение реакционноспособных ангидридных групп в состав синтетических полимеров. В этом случае получают носитель при сополимеризации эквимолярных количеств стирола и малеинового ангидрида. В присутствии избыточного количества диметилендиамина получают носитель, содержащий аминогруппы. Последние обладают высокой вместимостью по отношению к белкам, могут применяться как для ковалентной, так и нековалентной иммобилизации.

Полиакриламидный гель получается при сополимеризации производных акриловой кислоты со сшивающими агентами.

Полиакриламид — носитель, часто используемый для включения ферментов и клеток, не обладает ионообменными свойствами, поэтому при иммобилизации рН-профиль активности препаратов практически не меняется. По этой же причине не происходит ни обогащения, ни обеднения носителя заряженными субстратами и продуктами. Однако отсутствие взаимодействия включенных белков с носителем не способствует их удержанию. Для устранения утечки требуется высокая степень сшивки носителя, т. е. желательна как можно более полная полимеризация.

К сожалению, при высокой степени сшивки возникает проблема диффузионных ограничений. Таким образом, хотя включение препаратов в полиакриламидный гель используется довольно широко, методы иммобилизации, также как ковалентное сшивание с инертным носителем, имеют в этом случае определенные преимущества. Кроме того, полиакриламидный гель вследствие токсичности используемых для его получения мономеров (акриламида, бисакриламида) и выделении тепла при полимеризации снижает жизнеспособность клеток и ферментов. Но поскольку клетки значительно больше ферментов, то высокая степень сшивки необязательна. По этой причине для иммобилизации клеток в последнее время используют поперечносшитый и предварительно полимеризованный линейный полиакриламид.

Полиамидные носители — это группа различных гетероцепных полимеров с повторяющейся амидной группой –С(О)–NН–. Один из способов получения основан на гомополиконденсации аминокарбоновых кислот, например ε-аминокапроновой кислоты.

---

Носители на основе поливинилового спирта обладают высокой реакционной способностью. Соответствующая обработка позволяет вводить в них различные функциональные группы: альдегидные, хлортриазиновые, дисульфидные и др. Для получения гидрофильных гелей носители могут быть сшиты глутаровым альдегидом в кислой среде, а в щелочной — эпихлоргидрином. К достоинствам этих носителей следует отнести, помимо высокого содержания реакционноспособных групп, большую вместимость по отношению к белкам.

Гидрофильные полиуретановые полимеры, содержащие группировку –NH–C–O–, являются достаточно удобными материалами для включения препаратов в гель; процедура иммобилизации в этом случае состоит в простом смешивании компонентов. Полиуретанты обладают стойкостью по отношению к воде и окислителем по сравнению с полиамидами.

Неорганические материалы. Для иммобилизации используются различные типы неорганических носителей. Основными качествами, обуславливающими широкое внедрение неорганических материалов в промышленные процессы, являются легкость их регенерации и возможность придания им любой конфигурации. Носители применяются как в виде порошков, шариков, так и монолита.

Неорганические носители могут быть как пористыми, так и непористыми. К макропористым кремнеземам относятся силикагели, силохромы и макропористые стекла. Достоинства: механическая прочность, химическая инертность ко многим растворителям, наличие жесткого скелета с заданным размером пор, устойчивость к воздействию микроорганизмов. Поверхность частиц кремнеземов покрыта гидрофильными и гидроксильными группами, обладающими слабовыраженными кислотными свойствами. К недостаткам этих носителей следует отнести использование их в ограниченном диапазоне рН и некоторую неспецифическую сорбцию на их поверхности. Можно химически модифицировать кремнеземы путем введения различных реакционноспособных групп (–СN, –NO₂, –NH₂ и др.) или гидрофобизировать поверхность соответствующими реагентами.

Применение различных модифицирующих агентов дает возможность целенаправленного изменения свойства поверхности кремнеземных носителей. Однако стоимость кремнеземных носителей относительно высока, а модификация еще более повышает их стоимость, что является существенным ограничением во внедрении их в промышленности. Природные алюмосиликаты (глины, цеолиты), а также пористая керамика. Поверхность также может быть модифицирована различными органическими веществами. Они характеризуются высокой плотностью поверхностных групп,

---